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技术原理

PCR技术在水产养殖动物疾病诊断中的应用研究进展

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2021-11-10

    水产养殖业作为我国目前发展较快的农业产业之一.受到了越来越多的关注。已经成为全社会的投资热点。我国作为一个水产养殖大国。2004年水产养殖总产量达到了3209万吨.占世界水产养殖产量的70%以上.占全国水产品总产量的65%。

    2003年水产品进出I=1总量为443万吨.进出I=1总额达79.7亿美元.其中出口量210.3万吨.出1:3额54.9亿美元.水产品出口额占农产品出口总额25.6%。继续位居大宗农产品首位。随着水产养殖业规模的不断扩大和集约化程度的不断提高.水产养殖动物疾病不断出现。在我国,仅虾和蟹的普通病、寄生虫病、传染病、真菌病、细菌病和病毒病等

    就多达30余种[31。自1993年起。我国沿海养殖区大规模爆发对虾流行病。使其产量猝减60%70%。直接经济损失每年达35亿元人民币[41。由于常规的水产动物疾病检测手段存在准确性差、灵敏度低、耗时长等缺点.很难满足养殖生产者的需求。而现代分子生物技术中的聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction.eCR)就能很好的解决这一问题。目

    前。水产养殖业蓬勃发展。海参、海胆、扇贝等海珍品的海水养殖成为新一轮的投资热点。因此,PCR技术在水产养殖动物疾病诊断上的应用,对水产经济动物的健康养殖具有重要的意义。

    1常规PCR及其衍生技术在水产养殖疾病诊断中的应用

    1.1常规PCR的应用

    常规PCR的原理就是根据病毒或其他病原体的已知保守核苷酸序列设计出引物.对待测核酸的特异性片段进行扩增.之后对扩增产物进行电泳分析.通过是否能扩增出特异性条带来判断样品中是否有病原DNAVoytek等【5J根据Proteobaeteria亚纲的7个种的已知16SrRNA的序列.设计出通用引物.通过PCR在水生样品中检测出了细菌AmmoniumOxidizingBacteria。Oshima等I6]从海鲤脾中提取出DNA.并从中特异性地扩增出了编码真鲷虹彩病(Redseabreamiridovirus,RSIV)核糖核酸还原酶小亚基的一段基因。Altinok等从血样中提取了DNA.并通过鲁氏耶尔森氏菌(YersiniaJ1Jckein")的16SrRNA保守序列设计上游引物YER8

    (422F)和下游引物YER10(1010R),检测出了该病原体,并通过核酸杂交检测且证实了其准确性。在对虾白斑综合症病毒fwhiteSpotSyndromeVirus.WSSV1的检测上.Takahashi等等根据WSSVDNA的EcoRI-HindIII酶切片段设计引物.经PCR检测出了该病毒。薄清如等[91通过PCR技术.检测到虾蛄出也带有WSSV.从而说明其在病毒传染过程中可能起到了一定的作用。

    1.2RT—PCR的应用

    反转录PCR(Reversetranscription—polymerasechainYeaction.RT—PCR)。其原理就是用反转录酶将RNA转录为cDNA.之后用PCR对cDNA进行扩增虽然对于同一个病原体来说用PCR和RT。PCR都可以进行检测.但较PCR而言。RT—PCR显示出了更高的灵敏性。Rhodes等用RT—PCR很容易的从注射了10个单位细菌的组织中检测出了该细菌.而用基于DNA的常规PCR却只有在注射了10000个单位细菌的组织中才能检测出。但从其后的电泳结果来看并非DNA的提取有问题.这就说明了RT—PCR的灵敏性江育林等也用RT—PCR法快速检测出了桃拉病毒TauraSyndromeVirus.TSV)。陈晓汉等用引物VF和TSVR。充分结合一步法RT—PCR的优点和二温式PCR的优点检测出了南美白对虾桃拉病毒.显示出该方法耗时短、特异性强、灵敏度高的特点和较高的应用价值。Widada等[131根据诺达病毒fMacrobrachiumrosenbergiiNodavirus,MrNV)基因组的测序数据设计了四对引物.通过四

    对引物的结合.甚至可以从0.15ng组织中检测出病毒RNA.说明RT—PCR可以用于养殖动物病原体的Et常监测和进一步研究病原体和主体感染及免疫的关系等。Kiatpathomchai等[141根据黄头病毒(YelloWHeadVirus.YHV)的开放阅读框3设计了

    两对引物P64A1一P64S2和P64A1一P64S3.通过RT-PCR和半巢式RT—PCR检测出了该病毒.而所用的

    材料是虾的血淋巴.从而解决了把样品从较远的地方带到实验室的问题Nunan等也利用RT—PCR扩增出了对虾桃拉病毒(TSV)cDNA上231bp的一个片段。

    1.3定量PCR的应用

    定量PCRfquantitativepolymerasechainreac—tion)技术就是指以外参(样本与阳性参照在两个反应容器内反应)或内参(样本与阳性参照在一个反应容器内反应)为标准.通过对PCR终产物的分析或者是对PCR过程的监测.达到对PCR起始模板量定量的目的该方法很好的解决了PCR只能定性而不能定量的问题。以定量PCR方法观察病原体的数量变化.可以对病原体的增殖规律有感性的认识。为进一步确定不同时期差异表达基因。以及针对性的研究提供理论依据。目前在水产养殖动物的疾病诊断中已有了应用。兰永胜等利用定量

    PCR法对对虾白斑杆状病毒早期的感染和增殖进行了研究.并通过对26只Et本对虾的感染情况观察得到结论:感染对虾的存活时间与对虾质量不存在相关性。近几年来.实时荧光定量PCR(Rea1.timepolv—me:rasechainreaction)受到了很多的关注。其原理是在反应体系中加入荧光基团.利用荧光信号的积累实时监控整个PCR过程.通过标准曲线对未知

    模板进行定量分析。Tang等根据传染性皮下及造血组织坏死病毒fInfectioUSHypode:rmalandHaematopoieticNecrosisVirus.IHHNV1基因组序列中编码非结构蛋白的一段基因设计引物1608F和1688R,对该病毒进行了分析。显示了很好的特异性和敏感性.较传统方法.该法还有快速检测大批量样本的优点。Hirayama等利用Rea1.timeRT.PCR从鱼组织中检测出faquaticbimaviruses)ABVs,实验结果表明该法的灵敏度比巢式PCR要高10倍。Loisy等用Rea1.timeRT.PCR从牡蛎中检测出了诺沃克病毒(NorwalkViruS1.并指出了该法在其他材料中的应用潜力Dhar等别利用荧光染料SYBRGreenchemistry的rea1.timeRT.PCR从虾中检测出了r和YHVDhar等也利用该法从虾中检测出了IHHNV和自斑病毒(whitespotvirus。WSV)。Purce11等用rea1.timeRT.PCR检测出了传染性造

    血器官坏死病毒(Infectioushematopoieticnecrosis

    virus,IHNV)。这些充分说明了该法的优越性。

    1.4多重PCR和嵌套式PCR的应用

    从文献报道的应用范围上来看.这两种方法也有一些应用。但是却没有上述那些广泛。多重PCR(Multiplexpolymerasechainreaction)反应原理是在同一反应体系中同时加入多对引物.在同一个反应管中同时扩增多个目的基因.其优点是可以同时检测多种病原体,从而节省检测时间和检测资金。夏春等根据皮下及造血组织坏死杆状病毒(HepodermalandHematopoietieNecroisisBacu-1ovirus.HHNBV)XIA基因的序列fAB021155)设计了4个多重PCR引物fP1、P2、P3、P4)经电泳检测出了两条目的带,显示了很高的特异性。通过实验证明该法的最底检限为1fg/l,说明了很高的灵敏性.他们也同时检出了日本对虾杆状DNA病毒fPenaeidrod.ohapedDNAvirus,PRDV)和HHNBV。Coelho等设计专一性的引物采用Multiplex.RT.PCR从实验室养殖的牡蛎中同时检测出甲型肝炎病毒fHepatitisAvirus,HAV)、脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)和轮状病毒(Rotavirus)。但是天然状态下感染的却无法同时检出.这可能是由于病毒的浓度较少或提取过程中的部分丢失所致Russell等J利用牡蛎Crassostre凸virgin/c凸核糖体大亚基的基因设计引物同时扩增基因组DNA和单孢子虫.nelsoni、mo3"irtu——和H.costale.的基因,并通过和传统的组织病理学检测及RMFI"检测法的比较.证明了该法的优越性。Tsai——等(2002)通过multiplex.RT-PCR法采用引物9195F/9992R,94F2/R2。和ITSF/28SR同时扩增TSV、WSSV和虾Penaeusvannamei的基因组.第一次从中同时检测出了这两种病毒。

    嵌套式PCRfNestedpolymer——echainreac.tion)原理就是先利用一对引物.扩增包括靶DNA在内的长片段DNA。然后取少量的扩增产物。利用只针对靶DNA的引物再进行第二次扩增谢数涛等(2001)根据WSSV的部分核苷酸序列设计外引物和内引物。扩增显示,其灵敏度大约为一步PCR的104倍该法能检测出注射感染2h后对虾体内的WSSV(此时对虾外观正常1。因此在进行斑节对虾WSSV的早期快速诊断或早期感染研究有着更大的作用

    1.5连环恒温扩增技术的应用

    连环恒温扩增技术(1oop.mediatedisothermalamplificati0n,LAMP)。其原理是采可用内部和外部两对特异引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶。在65c【=左右对核酸进行扩增。短时间内可获得大量的拷贝。该法具有高特异性、高效性、快速、廉价、易检测等特点。Savan等【嚣]报道说该法已经用于了检测的病原体包括:迟钝爱德华氏菌(Edwardsiell凸tarda)、鲇鱼爱德华杆菌(E.ictaluri)、奴卡氏菌(Nocardi凸senolae)、三文鱼重要寄生生物Tetracapsuloidesbryosalmonae、WSSV及IHNV。Kono等【刎根据WSSV.DNA序列fAF3690291设计内引物FIP、BIP外引物F3、B3在65c【=进行连环恒温扩增检测了对虾白班病毒.同时通过和套式PCR的比较。其灵敏度比嵌套式PCR高l0倍。扩增时间lh

    也远远少与以前的3——4h.说明该方法在水产养殖动物的常规检测及疾病的早期诊断中有着很大的应用潜力Sun等【蚓用IHHNV基因组DNA设计了四种引物在64c【=恒温扩增.并通过高灵敏的DNA荧光染料(SYBRGreenI)和焦磷酸镁对产物进行了肉眼分辨。并证明了其灵敏度为PCR的100倍。2PCR与其他技术的联用PCR不仅自身可以用来检测病原体.也可以与其他技术相结合充分发挥其优点例如Sukhum.sirichart[31]等f2002)通过在反应体系中加人标记的dUTP.采用将PCR和酶联免疫吸附试验相结合(PolymeraseChainReaction.Enzyme.Linked-Immuno-sorbentAssay.PCR.ELISA1从虾中检测出了对虾肝胰腺细小病毒fHepatopancreaticPar-vovims,HPV),通过比较实验,说明其灵敏度是

    southe1TI杂交(Southernhybridization)的10倍,是常规PCR的20倍。该法避免了PCR中使用溴化乙锭的缺点.但是它也有实验成本较高的缺点。Schwab等采用一种从嗜热菌Thermusthermophilus中提取出的耐热性的同时具有反转录酶和聚合酶活性的酶rTth,与RT.PCR结合建立了DEIA(DNAenzymeimmunoassay)法检测出了诺沃克样病毒(Nor-walk.1ikeviruses。NLVs1,由于该法的结果是用数字表示的.这样也避免了电泳和Southern杂交时人的主观判断de1Cerro等【33]等利用基于TaqMan探针的PCR检测了病原F.psychrophilum.。Heath等【蚓等利用竞争PCR扩增鱼类的一种病原体Piscirick.ettsia5almonis的核糖体RNA基因间(IntemalTran.scribedSpacer,ITS)的部分序列,并用DGGE(变性梯度凝胶电泳)检测到了结果。Rajan等【蚓通过病原体damselaessp.Piscicida的基因序列设计前引物CPSF、后引物CPSR对其上410bp的一个片段进行了扩增并得到了理想的结果.但为了区别与另一种病原体dxtmselaessp.d铡e.又用到了TCBS(硫代硫酸盐.枸橼酸盐.胆盐.蔗糖)培养基,结果显示前者不能生长.而后着可以生长.两种技

    术间起到了很好的互补作用。另外,还有文献报道[a6JpCR与分子标记探针等其他技术的联和应用这些技术之间的联合应用都发挥了各自的优点.形成了常规方法无法比拟的优势。

    3存在的问题与展望

    目前.PCR技术已经在水产养殖动物的疾病诊断中得到了初步的应用.并衍生出了一些其他的技术形式通过PCR与其他技术的联用还解决了一些技术上的难题。但是。在实际的应用过程中还存在一些问题。例如.水产动物养殖生产者缺乏实验设备或实验设备不够先进、DNA萃取过程不当、实验试剂上的问题等。都会使检测的结果不够理想。因此.具有商业价值的针对不同病原体的试剂盒的开发及应用就显得非常的必要。这类试剂盒的应用将会简化养殖生产者的检测过程。并且提供更为准确的检测结果。由于大规模的检测会采取很多的养殖样品.Pantoja等【还建立了通过PCR分析感染了HPV的虾的排泄物的方法.这样就最小程度的减少了养殖上的损失为了更加精确的为未知序列的病原体设计引物.Lu等采用差异显示(diferentialdisplay)技术获得病毒基因组的相关信息.再根据其设计引物.从而为基于PCR的诊断做好了准备。运用PCR技术检测样品时.高质量模板的快速制备至关重要。为快速制备PCR模板,陈新华【矧等采用SolutionI(5mol/L盐酸胍、0.1mol/LEDTA(pH8.011裂解鱼、虾组织细胞,然后运用经浓硝酸处理过的Silicondioxidef二氧化硅1分离、富集从细胞中释放出的DNA.从而建立了一种从病毒感染鱼、虾组织中快速制备PCR模板的有效方法。实验中该方法只用时20min。具有非常大的应用潜力。另外,核酸提取时.从血液中取样可以达到从同一个体中重复取样以及在保证DNA的完整性不变的前提下长时间保存样品,为该方法的应用提供了新的思路【。

    近年来.海水养殖业蓬勃发展。2003年全国水产品总产量4706.1万吨.其中海水养殖产量为1253.3万吨,占总产量的26.6%【21。例如鱿鱼、海水鱼等高密度工厂化养殖。刺参的高密度养殖,每年都有较大幅度的增加。在刚开始的几年里。养殖生产者获得了较高的经济收入。但最近几年却暴发了如海参化板症、气泡病、细菌性溃烂病、盾纤毛虫

    病、腐皮综合症、霉菌病、扁形动物病、后口虫病等疾病,在山东、辽宁都有不同程度的发病,给海参养殖造成了很大的经济损失

    21世纪是海洋的世纪.海水养殖业的发展将很好的解决人类对食物的需求。快速、简便、灵敏的

    PCR检测方法为水产养殖动物的疾病诊断带来了曙光。PCR技术的不断完善、新的衍生技术的出现以及与其他新技术的联合应用.将极大的推动水产养殖业的发展。进而对人类解决食物来源及食物安全性等问题产生深远的影响。

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