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技术原理

PCR反应体系与反应条件的选择

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2021-11-09

    标准的PCR反应体系:

    10×扩增缓冲液   10ul

    4种dNTP混合物   各200umol/L

    引物        各10——100pmol

    模板DNA      0.1——2ug

    Taq DNA聚合酶   2.5u

    Mg2+       1.5mmol/L

    加双或三蒸水至  100ul

    PCR反应条件为温度、时间和循环次数。

    温度与时间的设置:

    基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90——95℃变性,再迅速冷却至40 ——60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70——75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100——300bp时)可采用二温度点法, 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。

    ①变性温度与时间:变性温度低,解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下,93℃——94℃lmin足以使模板DNA变性,若低于93℃则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性,就会导致PCR失败。

    ②退火(复性)温度与时间:退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃——60℃,可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度:

    Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T)

    复性温度=Tm值-(5——10℃)

    在Tm值允许范围内, 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合, 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30——60sec,足以使引物与模板之间完全结合。

    ③延伸温度与时间:Taq DNA聚合酶的生物学活性:

    70——80℃ 150核苷酸/S/酶分子

    70℃ 60核苷酸/S/酶分子

    55℃ 24核苷酸/S/酶分子

    高于90℃时, DNA合成几乎不能进行。

    PCR反应的延伸温度一般选择在70——75℃之间,常用温度为72℃,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般1Kb以内的DNA片段,延伸时间1min是足够 的。3——4kb的靶序列需3——4min;扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些。

    循环次数

    循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30——40次之间,循环次数越多,非特异性产物的量亦随之增多。

    聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点;能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断;可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情,用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。

    PCR的最早设想 核酸研究已有100多年的历史,本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术,Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想:“经过DNA变性,与合适的引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。

    PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制,只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA,寡核苷酸引物,DNA聚合酶,合适的缓冲体系,DNA变性、复性及延伸的温度与时间。

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