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技术原理

什么是引物?设计引物的原则注意事项

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2021-10-30

    什么是引物?引物是PCR特异性反应的关键,PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
    什么是引物?

    设计引物应遵循以下原则:

    ①引物长度: 15-30bp,常用为20bp左右。

    ②引物扩增跨度: 以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。

    ③引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

    ④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3’端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。

    ⑤引物3’端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

    ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处。

    ⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
    引物量: 每条引物的浓度0.1——1umol或10——100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。

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