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技术原理

PCR-ELISA技术的原理和临床应用进展

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2021-10-30

    聚合酶链反应(Polymerase chain reaction, PCR)技术自1989年开始被应用于临床检验以来,以其快速、简便、灵敏等优点很快地成为临床实验诊断学的一个技术热点。目前,已广泛用于涉及到核酸的科学研究以及临床疾病的诊断和治疗监测。PCR技术虽然作为一种新生的高新技术而代表临床实验诊断学发展的又一里程碑,但十多年的临床实践表明,传统的PCR技术本身还存在着一些问题,如产物污染导致的假阳性、不能准确定量等。为了解决上述问题,使PCR技术更适用于临术检测,经国内外学者的不懈努力,目前众多PCR衍生技术和相关技术已应运而生。本文将就国际上普遍接受的,国内SDA批准的Taqman技术、PCR-ELISA技术的原理和临床应用进展作一简单介绍。
    PCR-ELISA技术的原理和临床应用进展

    实时荧光定量PCR技术

    实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出。与常规PCR相比,它具有特异性更强,有效解决PCR产物污染、自动化程度高,同时能对起始模板进行准确定量等特点。

    一、实时荧光定量PCR的原理

    1. 荧光定量PCR反应原理

    实时荧光定量PCR反应是在常规PCR的一对引物之外,加入一个两端带有荧光标记的寡核苷酸探针。在探针完好的状态下,5´端报告荧光基团的激发光被3´端的淬灭荧光基团所抑制。PCR反应过程中,随着链的延伸,Tao酶沿着DNA模板移动到荧光标记探针的结合位置,发挥它的5´→3´外切核酸酶活性,将荧光探针切断,释放出报告荧光基团的荧光信号,每合成一个模板,一个报告基团的信号释放,被释放的激离报告荧光基团的数目和PCR产物是一对一的关系。通过定量PCR仪定时动态监测每一循环,可以得到样品实际扩增曲线,找到PCR扩增的对数期。软件通过标准品的待测品的对数期比较,得到每一样品模板DNA的起始拷贝数。

    2. 定量原理

    2.1  CT值  表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明,各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,CT值越小,反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代表CT值。因此,只要获得未知样品的CT值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

    2.2  荧光域值(threshold)的设备

    PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍,即threshold=10×Sdcycle6-15。荧光域值设定在PCR扩增的指数期。

    2.3  基线(Baseline)  是指在PCR扩增反应的最初数个循环里,荧光信号变化不大,接近一条直线,这样的直线即基线。

    二、实时荧光定量PCR的特点

    1  特异性  FQ-PCR具有引物和探针的双重特异性,故与传统的PCR相比,特异性大为提高。

    2  敏感性  FQ-PCR的敏感度通常达10²拷贝/ml,且线性范围很宽,为0-1011拷贝/ml。一般来讲临床标本中病原体的数目为0-1010/拷贝,在此范围内FQ-PCR定量较为准确,标本不需稀释。

    3  重复性  FQ-FCR结果相当稳定,同一标本的CT值相同,但其产物的荧光量却相差甚大。因为域值设置在指数扩增期,在此阶段,各反应组分浓度相对稳定,没有副作用,CT与荧光信号的对数呈线性关系。而当PCR反应进入平台期后,由于反应体系各组分的耗尽,酶活性的降低及产物的反馈抑制等原因导致产物不再增加。与终点法相比CT值能更稳定,更精确地反映起始模板的拷贝数。同时,因PCR是对原始待测核酸模板的一个扩增过程,任何干扰PCR指数扩增的因素如扩增孔间温度差异,标本中DNA聚合酶抑制剂的存在,加样的差异,待测标本中核酸模板的量等,都会影响扩增产物的量,因此,在扩增产物的数量与起始模板数量之间没有一个固定的比例关系,通过检测核酸产物很难对原始模板准确定量。

    4  降低产物污染的风险性

    三、FQ-PCR作为定量PCR的争议

    关于FQ-PCR能否作为一种定量PCR技术,目前存在着两种完全对立的学派,一派认为:Taqman技术不使用“内对照系统”只能作为一种定性的测定方法,原因是各反应孔的扩增效率是不同的。另一派认为实时荧光定量PCR无需内标,理由是:(1)CT值的重现性好。由于PCR循环在到达CT值所在的循环数时,刚刚进入真正的指数扩增期,此时微小的误差尚未放大,因此CT值重现性好,即同一模板不同时间扩增或同时间不同管内扩增,得到的CT值是稳定的。(2)由于CT值与起始模板的对数存在线性关系,因此,实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线的定量方法,无需做内对照。(3)内标会对实时荧光定量PCR产生不利影响。若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标,则PCR反应变为双重PCR,双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争,尤其当两种模板的起始拷贝数相差较大时,这种竞争会表现的更为明显。由于待测样品的起始拷贝数是未知的,所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因,传统定量方法虽然加入内标但仍然是一种半定量的方法。

    PCR-ELISA 技术

    一、原理

    PCR引物5´端标记上地高辛或生物素等非放射性标记物,扩增产物滴加到固定有特异性探针的微孔板上,再加入抗地搞辛或生物素酶标抗体一辣根过氧化物酶结合物,最终加底物显色,在酶标板上测定OD值判定结果。常规的PCR-ELISA只能作为一种定性试验,但若加入内标,作出标准曲线也可实现定量检测的目的。

    二、PCR-ELISA法的特点

    1. 特异性  近似于FQ-PCR,两者均具有引物和探针的双重特异性。

    2. 敏感度  较FQ-PCR略高

    3. 可加入内标,监测样品PCR受抑制情况,监测PCR平均效率,修正实验数据。

    4. PCR-FLISL法产物污染的风险性相对较大。

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