恒温扩增技术（LAMP）与实时荧光定量PCR（qPCR）技术讨论

作者：荧光定量PCR仪   发布时间：2020-05-26

    荧光定量PCR VS 恒温扩增，本文重点比较分子诊断中竞争较为激烈的恒温扩增技术（LAMP）和实时荧光定量PCR（qPCR）两种技术。

    1.检测成本

    基于LAMP的仪器更简单更便宜，但LAMP的引物设计难度高，试剂成本会相应高于qPCR。

    LAMP只要一个温度（65度左右），加热耗能更少，相对于qPCR的三个温度的循环，基于LAMP的扩增仪器的温控更容易实现。

    

    图一：qPCR技术需要三个温度的循环

    2.检测通量

    qPCR可以更好的实现高通量检测，对于qPCR而言，由于引物设计的成熟和荧光通道的多样性，往往可以比较好的实现高通量检测。

    而LAMP的引物一般需要4-6个（qPCR两个），且LAMP引物一般较长，LAMP的引物设计难于qPCR（虽然有LAMP引物检索网站的协助，但这个问题依然存在），引物设计困难也导致了LAMP的检测通量受限。

    

    图二：LAMP扩增一般需要6个引物

    3.检测灵敏度

    qPCR的检测灵敏度高于LAMP，意味着，同样的条件下，qPCR检测的假阴性概率低于LAMP

    案例一：

    Zhibing Lin等人的研究表明使用LAMP和qPCR（real-timePCR）分子诊断技术对于弓形虫DNA的检测极限分别是10fg/ul和1fg/ul[1]。

    

    案例二：

    Guangxiang Wang等人的研究表明在羊的口疮病毒检测中，LAMP正确识别出46只阳性中的41只（89.13%）; qPCR (real-time PCR)正确识别出了46只阳性中的42只(91.30%) [2]。

    案例三：

    Yi Tang等人的研究表明在坦布苏病毒的检测中，qPCR和LAMP的DNA检测极限分别为：2copies/ul和20copies/ul；RNA检测极限分别为10fg/tube和100fg/tube。

    检测出来的概率：qPCR和LAMP：82.6%和79.7%[3]。

    案例四：

    Chapey E.等人的研究表明，在临床弓形虫检测中，有一个病例qPCR检测出来了，LAMP没有检测出来；LAMP检测出来的qPCR均能检测出来；LAMP还有两个病例不确定，qPCR并没有 [4]。
    

    4.扩增特异性

    由于LAMP技术一般需要相对较长的6个引物，而qPCR一般2——3个引物，在核酸扩增中只有所有的引物序列都匹配才扩增，理论上基于LAMP的核酸扩增特异性更强。

    但扩增的特异性与引物的设计息息相关，并不能简单的比较两个技术的扩增特异性。比如基于两对引物的巢氏PCR的出现，大大的增强了qPCR特异性，这里最典型的应用实例就是filmArray，且LAMP对于扩增500bp以上的DNA比较吃力。

    

    图三：巢氏PCR技术进一步提高了扩增的特异性

    5.扩增速度

    基于LAPM的扩增速度快于qPCR的扩增速度。

    因LAMP扩增不需要反复的升温降温过程，可以短时间内获得大量的DNA产物，而qPCR的扩增速度往往取决于扩增仪器加热和冷却的速率，从这个角度上来看，LAMP更适用于定性的POCT初步确诊，但基于核酸扩增的qPCR能有效缩短诊断的“窗口期”，并且可以定量对病原体进行检测，实现早期诊断。

    另一方面，LAMP扩增的快速也导致了终产物的浓度高，交叉污染的概率也大大提高，容易导致假阳性高，且因为没有PCR的温区切换过程而显得比较紊乱，不利于后续的定量。

    

    图四：PCR扩增过程

    6.抑制剂敏感性

    LAMP对样品中抑制剂敏感性低于qPCR，意味着LAMP对扩增环境的要求低于qPCR。

    综上对比，荧光定量PCR与恒温扩增各有优劣，到底该选择哪个？
    

    基于需求出发，LAMP虽然很好的解决了PCR的温控难题，让检测过程更快速简单，但是也相应带来了其他的问题，比如相对于qPCR而言，检测灵敏度不够，引物设计更困难等。从简便性而言，LAMP比荧光定量PCR操作更为方便，但从临床应用而言，荧光定量PCR的检测结果更为可信。

    但不管是LAMP还是荧光定量PCR，都还在不断的优化和发展，我们期待着分子诊断技术的成长，为临床诊断带来更好的服务。