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恒温扩增技术(LAMP)与实时荧光定量PCR(qPCR)技术讨论

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2020-05-26

    荧光定量PCR VS 恒温扩增,本文重点比较分子诊断中竞争较为激烈的恒温扩增技术(LAMP)和实时荧光定量PCR(qPCR)两种技术。

    1.检测成本

    基于LAMP的仪器更简单更便宜,但LAMP的引物设计难度高,试剂成本会相应高于qPCR。

    LAMP只要一个温度(65度左右),加热耗能更少,相对于qPCR的三个温度的循环,基于LAMP的扩增仪器的温控更容易实现。

    qPCR技术需要三个温度的循环

    图一:qPCR技术需要三个温度的循环

    2.检测通量

    qPCR可以更好的实现高通量检测,对于qPCR而言,由于引物设计的成熟和荧光通道的多样性,往往可以比较好的实现高通量检测。

    而LAMP的引物一般需要4-6个(qPCR两个),且LAMP引物一般较长,LAMP的引物设计难于qPCR(虽然有LAMP引物检索网站的协助,但这个问题依然存在),引物设计困难也导致了LAMP的检测通量受限。

    6个引物

    图二:LAMP扩增一般需要6个引物

    3.检测灵敏度

    qPCR的检测灵敏度高于LAMP,意味着,同样的条件下,qPCR检测的假阴性概率低于LAMP

    案例一:

    Zhibing Lin等人的研究表明使用LAMP和qPCR(real-timePCR)分子诊断技术对于弓形虫DNA的检测极限分别是10fg/ul和1fg/ul[1]。

    实验数据

    案例二:

    Guangxiang Wang等人的研究表明在羊的口疮病毒检测中,LAMP正确识别出46只阳性中的41只(89.13%); qPCR (real-time PCR)正确识别出了46只阳性中的42只(91.30%) [2]。

    案例三:

    Yi Tang等人的研究表明在坦布苏病毒的检测中,qPCR和LAMP的DNA检测极限分别为:2copies/ul和20copies/ul;RNA检测极限分别为10fg/tube和100fg/tube。

    检测出来的概率:qPCR和LAMP:82.6%和79.7%[3]。

    案例四:

    Chapey E.等人的研究表明,在临床弓形虫检测中,有一个病例qPCR检测出来了,LAMP没有检测出来;LAMP检测出来的qPCR均能检测出来;LAMP还有两个病例不确定,qPCR并没有 [4]。
    临床弓形虫检测

    4.扩增特异性

    由于LAMP技术一般需要相对较长的6个引物,而qPCR一般2——3个引物,在核酸扩增中只有所有的引物序列都匹配才扩增,理论上基于LAMP的核酸扩增特异性更强。

    但扩增的特异性与引物的设计息息相关,并不能简单的比较两个技术的扩增特异性。比如基于两对引物的巢氏PCR的出现,大大的增强了qPCR特异性,这里最典型的应用实例就是filmArray,且LAMP对于扩增500bp以上的DNA比较吃力。

    巢氏PCR技术

    图三:巢氏PCR技术进一步提高了扩增的特异性

    5.扩增速度

    基于LAPM的扩增速度快于qPCR的扩增速度。

    因LAMP扩增不需要反复的升温降温过程,可以短时间内获得大量的DNA产物,而qPCR的扩增速度往往取决于扩增仪器加热和冷却的速率,从这个角度上来看,LAMP更适用于定性的POCT初步确诊,但基于核酸扩增的qPCR能有效缩短诊断的“窗口期”,并且可以定量对病原体进行检测,实现早期诊断。

    另一方面,LAMP扩增的快速也导致了终产物的浓度高,交叉污染的概率也大大提高,容易导致假阳性高,且因为没有PCR的温区切换过程而显得比较紊乱,不利于后续的定量。

    PCR扩增过程

    图四:PCR扩增过程

    6.抑制剂敏感性

    LAMP对样品中抑制剂敏感性低于qPCR,意味着LAMP对扩增环境的要求低于qPCR。

    综上对比,荧光定量PCR与恒温扩增各有优劣,到底该选择哪个?
    选择对比

    基于需求出发,LAMP虽然很好的解决了PCR的温控难题,让检测过程更快速简单,但是也相应带来了其他的问题,比如相对于qPCR而言,检测灵敏度不够,引物设计更困难等。从简便性而言,LAMP比荧光定量PCR操作更为方便,但从临床应用而言,荧光定量PCR的检测结果更为可信。

    但不管是LAMP还是荧光定量PCR,都还在不断的优化和发展,我们期待着分子诊断技术的成长,为临床诊断带来更好的服务。
 

    参考文献:
    1. LinZ, Zhang Y, Zhang H, et al. Comparison of loop-mediated isothermalamplification (LAMP) and real-time PCR method targeting a 529-bp repeat elementfor diagnosis of toxoplasmosis[J]. Veterinary parasitology, 2012, 185(2):296-300.
    2. WangG, Shang Y, Wang Y, et al. Comparison of a loop-mediated isothermalamplification for orf virus with quantitative real-time PCR[J]. Virologyjournal, 2013, 10(1): 138.
    3. TangY, Yeh Y T, Chen H, et al. Comparison of four molecular assays for the detectionof Tembusu virus[J]. Avian Pathology, 2015, 44(5): 379-385.
    4. ChapeyE. et al. An evaluation of a loop-mediated isothermal amplification (LAMP)assay to detected Toxoplasma gondii in clinical specimens.

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