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目的基因的扩增,聚合酶链式反应PCR原理与过程

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2020-05-26

    一、聚合酶链式反应的基本过程

    聚合酶链式反应(PCR)是通过PCR仪,模拟DNA半保留复制,从而体外快速扩增DNA的方式。生物实验室要用到PCR的地方……简直数不胜数。比如扩基因、检测、吃螺师粉儿(什么鬼……)等等。

    典型的PCR包括高温变性、低温退火、中温延伸三个步骤,通过将这一套过程不断循环,使DNA得以成百万倍的扩增。当然这是典型的……不典型的PCR五花八门,等以后用到再跟大家分享( °△ °|||)。

    因此所谓的PCR仪,其实就是一套自动温控系统,早先人们做PCR都是用水浴锅来做,指甲盖大小的离心管,在三个锅子里来回倒来倒去,拼个手速,攒个人品,好不热闹。这么想想,其实现在实验室还是蛮幸福的。

    高温变性:所谓变性是95℃左右时DNA双链打开的过程,使之能够与引物结合,为下面的反应做准备。但是注意考点:这里的DNA不只是我们加进去的模板DNA,还包括扩增出来的DNA,体系里但凡是双链,高温都能给他打开了。这个过程大约需要5 min左右,再长就煮熟了。

    低温退火:退火是个很亲切的词,这是我们做无机非金属里面的概念,不知道是哪位巨巨给引入了生物学。所谓退火就是适宜条件下冷却的过程,上面说到DNA高温变性,变性后的单链与引物通过碱基互补配对,再次形成局部双链。更准确的来讲应该叫复性,恢复双链的过程。

    中温延伸:模板-引物接头之后,对你没看错,人家就叫接头,浓浓的社会气息。延伸就是在72℃、TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为原料,以靶向序列为模板,碱基互补配对为原则,再次合成完整的双链DNA的过程。我们可以看到这里复制之后实际上有一条链是新合成的,另一条则是原先就存在的,因此说这叫半保留复制。
    聚合酶链式反应的基本过程

    二、聚合酶链式反应的组成成分

    1.模板(1 ng/μL)

    模板DNA可以从各种生物组织中得到,通常浓度为1 ng/μL。浓度不是越高越好,浓度太高会导致大量的非特异性结合。

    2.引物(10 μmol/L)

    引物浓度通常是10 μmol/L。

    引物浓度太低,产量较低;

    引物浓度太高,引起错配、非特异性以及引物二聚体。

    一般都是商用的合成好之后直接用就好。

    3.Taq酶(5 U/μL)

    U是酶活力单位,定义为:25℃下(其它为最适条件),1分钟内能转化1 μmol底物的酶含量,或是转化底物中1 μmol有关基团的酶含量。

    4.dNTP(2.5 mmol/L)

    dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,从而影响DNA聚合酶的活性。

    5.Buffer(含Mg2+)

    Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。

    Mg2+浓度过低会使DNA聚合酶活性降低,PCR产量下降。

    Mg2+浓度过高会使特异性降低。

    三、聚合酶链式反应的体系

    聚合酶链式反应的体系

    四、聚合酶链式反应的结果

    琼脂糖凝胶电泳检测以大肠杆菌碱性磷酸酶(AKP)为例,进行琼脂糖凝胶电泳检测,结果如下。
    琼脂糖凝胶电泳检测结果

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