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荧光原位杂交的技术原理与应用

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2020-05-16

    荧光原位杂交技术问世于70年代后期,其曾多用于染色体异常的研究。从20世纪90年代至今,荧光原位杂交技术在方法上逐步从单色向多色、从中期染色体FISH向粗线期染色体FISH到纤维(fiber)-FISH发展,其灵敏度和分辨率也有了大幅度进步。

    荧光原位杂交基本原理

    荧光原位杂交技术原理

    荧光原位杂交应用荧光染料标记探针 DNA,变性成单链后与变性后的染色体或细胞核靶DNA杂交,在荧光显微镜下观察并记录结果。

    1. 多色荧光原位杂交

    首要,Cremer等用生物素和汞或氨基乙酰荧光素(AFA)标记探针建立了双色荧光原位杂交(FISH)技能。然后1990年Nederlof等提出用3种荧光素勘探3种以上的靶位DNA序列,创建了多色荧光原位杂交方法。在此基础上又建立了以下5种方法:

    染色体描绘;

    回转染色体描绘;

    多五颜六色原位启动标记;

    比较基因组杂交;

    光谱染色体自动核型剖析;

    交叉核素色带剖析。

    可将屡次繁琐的FISH试验和多种不同基因的定位在一次FISH试验中完成。

    2.DNA纤维荧光原位杂交

    Weigant等和Heng等首要使用化学方法将染色体进行线性化,再以此线性化的染色体DNA作为载体进行FISH,使FISH的分辨率显著进步。Parra和Windle(1993),Heiskanen等(1994),Florijn等(1995),进一步改进了扩展DNA纤维的方法,使DNA纤维的扩展程度从最初的80 kb/um达到了现在的2.5——3.5 kb/um。

    荧光原位杂交技术应用

    1.技术特点:

    (1)操作简便,立体分辨率高,调查剖析便利,信号亮堂明晰以及安全风险小;

    (2)检测速度及探针安稳性比放射性标记探针好,探针标记后安稳,一次标记后可运用二年;

    (3)方法灵敏,能迅速得到结果;

    (4)在同一标本上,使用不同颜色的荧光集团标记探针可一起检测几种不同的探针;

    (5)不仅可用于分裂期细胞染色体数量或结构变化的研讨,而且还可用于间期细胞的染色体数量及基因改动的研讨;

    (6)标记探针和荧光素试剂均可置办,使得FISH程序直接而牢靠;

    (7)某种特别品种的完整基因组、整个染色体、染色体亚区域或单拷贝序列依所用探针的杂乱性可特异地分别开来;

    (8)重复序列的杂交可被未标记基因组的DNA同探针预杂交而按捺,这对定位在大植入探针中的独特序列是决定性的。

    2.在基因定位中的应用

    荧光原位杂交技术能够直接测定DNA序列在染色体上的定位状况,基因的染色体定位是FISH在分子生物学上运用的重要方面。荧光原位杂交(FISH)技能还为当时着丝粒结构研讨供给了重要的研讨手法,主要是对着丝粒重复序列的剖析,包含重复元件,如α、β和传统卫星DNA的性质和散布。FISH能够直接调查染色体端粒,简化了对其在核内的结构和功能研讨,定位其端粒序列。

    3.在染色体结构研讨中的应用

    荧光原位杂交技术能够直接调查染色体形态结构,也能调查细胞核内染色质,可阐明减数分裂染色体的高度有序结构,有助于了解减数分裂染色体配对和重组的机制。而荧光原位杂交技术用人染色体特异探针能有效地检测出人类和灵长类动物染色体畸变类型。染色体RNA和基因组进化研讨供给技能支持。

    4.在微生物生态学中的运用

    荧光原位杂交技术具有很多长处,如快速、准确、原位等,因此目前在微生物生态学各个领域研讨中已成为了强有力的工具。如环境样品中微生物多样性的检测、污水处理相关微生物多样性研讨、动物体内共生微生物的研讨、剖析杂乱的微生物群落等。

    5.在医学中的运用

    荧光原位杂交技能可用于病源微生物诊断、产前诊断、绘制基因图谱、癌症基因的检测和判断等。

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