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常见问题

多聚酶链式反应-PCR扩增技术的总结与深化

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2020-07-20

    PCR扩增技术形成的子代DNA分子是以引物序列为起点的DNA分子片段;体内DNA复制形成的是完整的子代DNA分子。

    【深化】

    题型1.引物与模板链正确连接的保证

    问题:什么是退火?退火的两个关键实现目标是什么?依据不同的模板和引物结合时的重要因素是什么?

    退火:高温变性后,降低温度至55-60℃,实现模板单链与引物配对结合。

    目标:引物与模板链相应序列特异性碱基互补配对,并成功结合形成氢键。(也就是说会存在很多可能的非特异性结合)

    重要因素:温度设定(高低、时间)

    思考1:进行扩增时,反应的温度和时间需根据具体情况进行设定,下列选项中__________的设定与引物有关,________的设定与扩增片段的长度有关。(填序号)①变性温度 ②退火温度 ③延伸温度 ④变性时间 ⑤退火时间 ⑥延伸时间

    答案: ②  ⑥

    思考2:为什么引物中GC含量越高,需要设定更高的退火温度?

    GC碱基互补配对时形成三个氢键,非特异性配对后需要较高的温度才能打开氢键,从而促进特异性配对。

    [总结] 引物与模板链正确连接的保证

    1. 退火温度很重要。

    (1)引物与模板结合的温度参数。要保证退火温度足够低,保证引物与目的序列的有效结合;退火温度又要足够高,以减少非特异性结合。

    (2)退火温度与碱基比例关系很大。

    ①GC(40%-60%),比例太高会使退火温度过高,从而无法实现引物与模板结合。

    ②两种引物碱基比例相似,以保证相同的退火温度。

    2. 保证引物与模板特异性结合

    (1)碱基要随机分布,且与模板内部序列没有较高的相似性。(即使这样还是会有个别碱基相连的情况,但是足够高的退火温度可以打开个别氢键)

    (2)引物自身及两引物之间不应存在互补序列(少于5个相同的碱基连续排列)。(防止引物形成发卡结构或者两引物发生互补配对)

    例:设计引物时需要避免引物之间形成________________,而造成引物自连。

    答案:碱基互补配对。错答:相同末端或相同黏性末端或相同平末端。末端特指双链DNA分子的端位碱基,是专用名词,不可以用在单链引物上。且引物之间的碱基互补配对不一定是所有碱基都能够互补配对,少量配对也会使两种引物结合在一起,从而不能获得特异性DNA产物。

    题型2.有关引物的计算

    思考1:至少复制几次可以得到独立的目的基因?

    答:3次

    思考2:复制n次需要加引物多少个?

    答:2.2n-2个。

    思考3:引物一般需要20-30个核苷酸序列,为什么?

    答:增强识别序列的特异性

    思考4:复制n次,同时含有两种引物的DNA分子所占比例是多少?

    答:2n-2

    思考5:复制n次后,双链等长的DNA有几个?

    答:2n-2n个。

    题型3.设计引物的原因、引物的化学本质及设计原则

    引发思考的问题:利用PCR技术获取目的基因的前提是什么?

    答:要有一段已知目的基因的核苷酸序列,以便根据这一序列合成引物。

    PCR扩增技术为什么要设计引物

    答:在PCR中DNA聚合酶不能从头合成DNA,只能从3’端延伸DNA新链,DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到已有的核酸片段上,因此,DNA复制需要引物。

    引物的化学本质是什么?

    答:引物是一小段DNA或RNA,在PCR中是DNA,细胞内一般是RNA。

    对引物设计有哪些注意事项?

    答:(1)碱基要随机分布,且与模板内部序列没有较高的相似性。

    (2)引物自身及两引物之间不应存在互补序列(少于5个相同的碱基连续排列)。

    (3)引物长度一般在15-30个碱基之间。过长会导致延伸温度大于74℃,不适于Taq酶进行反应。(为什么呢?有个具体的计算公式,不详述)

    例题1.如图所示,引物应选用              ,而不能选择其他引物。

    答案:A和D

    例题2.为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒,拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置,PCR鉴定时应选择的一对引物是__________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段,原因是_______________。

    答案:乙丙      目的基因反向连接

    例题3.下图为某种转基因抗病棉花培育过程图,请据图回答下列问题:

    (1)利用的基本原理是         。利用该技术扩增目标DNA片段(子链的延伸方向从5'→3'),应选择图中的引物           (填字母)与模板DNA结合。

    (2)PCR过程中,子链延伸需要引物的原因是              。PCR技术通常需要长度为20——30个核苷酸的DNA片段作为引物,如果引物过短,则对扩增结果的影响是                 。

    答案:(1)DNA复制  B、C(2)DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到已有的核酸片段上    会扩增出更多的非目标 DNA分子)

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