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常见问题

影响PCR反应做的内部因素和外部因素

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2020-07-17

    一个PCR反应过程分为很多的步骤,同时也受到很多因素的影响,可以分为内部因素和外部因素,内部因素是指正常试剂体系中的成分,外部因素是指环境或者样本带入的因素。

    体系内部因素

    引物:PCR引物设计是整个反应体系最重要的部分,也是决定一个PCR反应特异性的关键,引物在设计时要遵守一定的原则(长度、扩增跨度、碱基等)。

    酶及其浓度:目前有两种Taq DNA聚合酶,一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠杆菌合成的基因工程酶,酶浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。

    dNTP的质量与浓度:dNTP溶液呈酸性,一般配置成体系需将其调节至7.0-7.5,正常情况下4种dNTP的浓度应该相等,如果其中某一种过高就会引起错配,浓度过低又会引起PCR产物的产量。

    模板核酸(靶标):模板核酸的量和纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,对于RNA模板更要注意RNA的降解。

    Mg2+浓度:主要影响PCR扩增的特异性和产量,一般要对应dNTP的浓度。Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异性扩增,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少。

    温度与时间的设置:PCR原理三步骤涉及变性-退火-延伸三个温度点,也就是变性温度与时间、退火(复性)温度与时间、延伸温度与时间。

    循环次数:循环次数决定PCR扩增程度,PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般温度循环次数在30-40次之间,循环次数越多,非特异性产物的量就越多。

    体系外部因素

    SDS:离子去污剂,0.01%即可完全抑制PCR反应,0.005%可显著降低产量

    苯酚:0.5%即可完全抑制PCR反应,0.2%可显著降低产量

    乙醇:大于1%的浓度可抑制PCR反应,但在某些体系里又能增加产量

    异丙醇:抑制作用比乙醇稍强

    乙酸钠:大于5mM时抑制PCR反应

    氯化钠:大于25mM时抑制PCR反应(生理盐水无影响)

    EDTA:0.5mM可使PCR产物减少,1mM完全没有PCR产物

    血红素(heme)-来源:血液,大于1mg/ml抑制PCR反应

    氯高铁血红素(hemin):大于0.1ng/μl抑制PCR反应

    丹宁酸(tannic acids):大于0.1ng/μl抑制PCR反应

    肝素:大于0.15IU/ml抑制PCR反应

    尿素-来源:尿,大于20mM时产生抑制

    腐殖质-来源:土壤,植物材料,自然界水

    植物多糖-来源:粪便,植物多糖

    聚苯乙烯,聚丙烯-来源:紫外线照射塑料管

    胆酸盐-来源:粪便

    胶原质-来源:组织

    靛青染料-来源:粗斜纹棉布,牛仔裤

    蛋白酶-来源:牛奶

    钙离子-来源:牛奶,骨头

    铁离子-来源:血液

    二甲苯胺

    溴酚兰

    胆红素(bilirubin)

    其他抑制剂

    除上述抑制剂外,还存在一定的PCR增强剂,比如甜菜碱、二甲基亚砜、甲酰胺、甘油、PEG、亚精胺和单链DNA结合蛋白等,但是在高浓度情况下,也会对PCR产生抑制,因此如何采用增强剂消除抑制剂的影响,采用多少的浓度对结果都存在很大的影响。

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