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常见问题

荧光标记选择之探针法和染料法

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2020-07-16

    之前我们提过荧光定量PCR的关键物质——荧光,今天就接着来说一下在荧光定量PCR检测过程中,PCR产物的荧光标记选择之探针法和染料法。

    特异性荧光标记——探针法:

    探针法

    是目前临床最常用的方法,在加入一对引物的同时再加入一对探针,特异性好,这里列举的是TaqMan水解探针:一段与靶基因特异性结合的序列,分别在5’端加入荧光报告基团,3’端加入荧光淬灭基团。其核心是利用taq酶的5’-3’外切酶活性切断探针,使得使荧光报告基团和荧光淬灭基团分离,从而使荧光监测系统可接收到荧光信号,每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步,荧光强度就可代表模板数量。

    非特异性荧光标记——染料法:

    染料法

    一般采用DNA染料SYBR® Green I,染料能够与双链结合,发出荧光,它自身也会发出微弱的荧光,应用体系内所有荧光的信号强度与DNA量成正比,所以它对模板没有选择性,且不需要设计复杂的探针,经济实惠。但是也因此暴露缺陷,染料能与所有双链DNA结合,导致非特异性扩增和引物二聚体也会被检测出,并干扰结果。有缺陷就有补救的方法,溶解曲线的分析能帮助操作者判断产物的特异性,溶解曲线是指随温度升高DNA的双螺旋结构降解程度的曲线。单一峰的溶解曲线说明扩增特异性好,有双峰代表出现了非特异扩增或引物二聚体。

    报告荧光:6-FAM、JOE、VIC、NED、CY3、Texas RED、CY5

    淬灭荧光:MGB-NFQ、TAMRA、BHQ

    参比荧光:ROX

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