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常见问题

超详细:荧光定量PCR详细新手入门知识

作者:吉玛基因   发布时间:2020-06-17

    前言:新冠病毒的肆虐突然就将原本对分子生物学了解不多的人们拉近了与分子检测的距离。目前的新冠病毒核酸检测绝大多数都是采用荧光定量PCR方法,对病毒RNA运用逆转录后PCR的方式扩增目的序列进行检测。这里再次对PCR实验进行简单介绍。

    聚合酶链式反应,PCR(polymerase chain reaction):,是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术;是指在引物存在的条件下,以DNA为模板,由DNA聚合酶催化的对特定基因或DNA序列进行体外快速扩增的反应,又称为基因体外扩增法。

    荧光定量PCR技术,是在PCR反应体系中加入荧光报告系统,利用荧光信号的变化对PCR过程进行实时监控,实现对起始模板的定量检测。

    1. 荧光定量PCR几个基础概念:

    PCR技术

    基线:是指扩增曲线的水平部分。是指在PCR扩增反应的最初数个循环里,荧光信号变化不大。接近一条直线,这样的直线即是基线。每个样品孔都设置独立基线。

    阈值:是一个荧光强度值,荧光域值必须设定在 PCR扩增的指数期。

    阈值线:穿过阈值与X轴平行的直线称为阈值线;

    Ct值:是阈值线与扩增曲线的交点对应在X轴上的值,是循环数。

    2. 荧光定量PCR技术为什么可以用来做精确定量检测:

    PCR技术

    典型的扩增曲线包括基线期,指数增长期,线性增长期和平台期;

    基线期虽然在进行指数扩增,但是荧光信号变化不大;

    指数增长期在进行指数扩增,荧光信号也在以指数增长;

    线性增长期虽然荧光在增长,但其增长无明确的数学关系;

    平台期荧光几乎无增长,说明反应体系内DNA含量基本稳定,几乎不在增加。

    以上4个时期是根据其扩增过程中的特征人为划分的,之间并无明确的界限;且只有在基线期和指数期是保持严格的数学关系进行指数扩增的;所以将阈值线划在指数增上期,得到的CT值可以用来代表起始模板量,故可以用来做精确的定量检测。

    3. 荧光定量PCR检测流程:

    荧光定量PCR检测一般流程如下图,选择检测靶标基因,进行引物筛选及体系构建,后续进行样本处理核酸提取,检测分析结果。
    PCR检测流程

    4. 荧光定量PCR实验设计:

    4.1 设置对照组:

    荧光定量PCR检测一般流程如下图,选择检测靶标基因,进行引物筛选及体系构建,后续进行样本处理核酸提取,检测分析结果。

    对照组是实验的监控系统,监测实验是否有存在异常,也是排除实验异常关键所在;

    实验对照设置: 通常有阳性对照,阴性对照组等。
    设置对照组

    具体可根据实验类型进行对照组的设置;对照组是实验分析的依据,对照组设置的充分合理。

    4.2重复试验:

    实验是否具备重现性是可信度的体现;一般荧光定量PCR都会做3个PCR复孔;不过PCR复孔处于实验流程的最末端,只是对PCR操作的重复;重复性可设计在逆转录、样本提取等的重复操作,统计得到实验的重现性。
    重复试验

    根据实际情况选择重复实验的设置;重复的意义从低到高依次为:PCR复孔,逆转录复孔,样本重复,实验重复;整个实验具备重复性说明实验可信度很好。

    5. 荧光定量PCR数据分析:

    首先看基线与阈值设置的是否合理;在基线和阈值设置合理的基础上,得到的CT值才是准确可靠的;在CT值是准确的基础上再进行相对定量或绝对定量实验。

    数据分析

    5.1 绝对定量实验数据分析注意要点:

    5.1.1 绝对定量实验对检测体系的扩增效率不做硬性要求;

    5.1.2 检测的样本浓度必须落在标曲线性范围之内;否则该样本检测浓度不在此标曲有效范围内,需要根据实际情况扩大标曲的范围或对样本进行稀释或浓缩使之落在标曲线性之内;

    5.1.3 标曲与待测样本必须在同一趟实验上进行才有效,不可用不同趟实验的标曲进行绝对定量计算;
    数据分析

    数据分析

    5.2 相对定量实验数据分析注意要点:

    5.2.1 相对标准曲线法:注意要点同绝对定量;

    5.2.2 2的-δδCt法: 本方法要求靶标基因和内参基因的扩增效率尽可能相等且接近100%; 参比样本

    和实验样本的靶标基因和内参基因在同一趟实验中进行检测;

    靶标基因

    数据分析

    6.荧光定量PCR操作注意点:

    荧光定量PCR属于精密性试验,需要专业人员操作,在操作过程中需要注意各方面细节实验以保证荧光定量PCR实验步骤的可靠可重复性。

    6.1 荧光定量PCR操作注意点:

    实验室注意分区:试剂准备间,样本处理间,PCR室,电泳间要有明确区分,各房间实验室的实验服不得混用;

    试剂准备间及样本处理间不处理实验相关的高浓度的核酸模板(如高浓度的标准品,PCR产物,miRNA的minics等);

    减少频繁多次的走动,尤其去过电泳间之后当天不可进入其他房间;

    使用生物安全柜加样,不同位置的移液器不可混用,不要随意更换其位置;

    在检测体系中添加UNG酶系统用于避免PCR产物的污染。

    6.2 试剂质量控制:

    对每批次配制或购买的试剂进行质检,保证试剂的性能稳定可控,均一。

    6.3 试剂使用注意事项:

    试剂使用前必须混匀。

    6.4 移液器操作注意事项:

    使用结束后调整至最大量程,取样时枪头深入页面的深度尽量一直保持在1-2mm之间,避免外壁沾过多试剂随加样进入导致重复性不好。

    6.5 反应液配制及注意事项:

    加样使用合适量程的移液器;对于较小体积的移液,取液时候,不可深入液体太多以免试剂沾到吸头外壁至移液量不准确,深入1-2mm即可(尤其是粘稠试剂,如酶,甘油等);

    小体积试剂加样务必:取液后眼观是否取到液体,加样务必浸入混合液一下吹吸数次,弃吸头前眼观确定吸头中无残留。

    6.6 反应液分装及注意事项:

    反应液分装前必须混匀(比如涡旋震荡或移液器吹吸混匀)再分装;反应液第一个孔分装必须润一下枪头,96孔之间加样间隔时间尽量保持一致,96孔的点样位置尽量保持在96孔的相同位置,复孔之间尽量相邻点样,点样按照一定的顺序,吸取时枪头深入页面的深度尽量一直保持在1-2mm之间;

    加样使用移液器镶紧移液器吸头,每次按至第一档即可,不可按至第二档,避免气泡产生和加样不准确(注:这个并不是唯一使加样准确的方式,只要保持所有孔的加样方式相同,可减少加样误差;)加样尽量匀速,不要加样到孔外面,以免对后面封膜造成影响;

    点样结束后,观察是否有漏加样本,或加错样本。

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