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常见问题

如何选择新冠病毒基因组测序的方法和策略?

作者:华大智造   发布时间:2020-06-10

    高通量测序之于病毒基因组,在检测和研究中的意义和价值已得到广泛验证。但在开展具体的高通量测序工作时,可能会面临很多实际的操作问题,譬如:方法上选择宏基因组测序还是靶向测序?测序策略上选择多少数据量、何种读长?哪些测序平台的通量和数据量更能满足实验室检测要求?以新冠病毒为例,本文对高通量测序在检测和研究中可能面临的问题与选择进行一一剖析。

    在检测和研究中可能面临的问题与选择

    图1 在检测和研究中可能面临的问题与选择

    测序目的:快速检测or序列组装?

    高通量测序技术应用于新型冠状病毒的检测和研究,可以实现快速检测以及病毒序列组装。测序目的不同,需要选择合适的方法和策略:如需对qPCR检测呈阴性的疑似病例进行确诊,或对复合性感染、继发性感染等进行鉴别诊断,或对大量待测样本进行大规模筛查,可以利用高通量测序技术进行快速检测;如果需要实现病毒序列组装,以进行未知病原的检测、分析和研究,可以利用高通量测序技术进行更高深度更高覆盖度的测序,获得完整的病毒基因组序列。

    测序方法:宏基因组测序or靶向测序?

    对病毒基因组进行高通量测序,可以采取宏基因组测序或靶向测序(包括探针捕获测序和多重PCR扩增子测序)。不同的方法各有优势,可根据实际应用进行选择。
    不同高通量测序方法的比较

    图2 不同高通量测序方法的比较

    可供参考的建议如下:

    1. 对未知病原的发现及确认,首选宏基因组测序;

    2. 如需检测或研究样本中所有可能感染的微生物,比如诊断不明原因感染、混合感染、继发感染等,可以选择宏基因组测序;

    3. 如只需针对目的病毒进行检测,希望以较少的数据量获得目的病毒全长序列,可以选择靶向测序。

    测序数据量

    关于测序数据量,需结合具体的测序目的、测序方法、样本病毒载量等因素进行综合评估。通常,提高测序数据量,可以提高检测灵敏度,改善临床检测的阳性率。另外,提高测序数据量,可以提高数据覆盖度,病毒序列组装效果更好。以满足病毒基因组覆盖度>95%,且单碱基深度>10x为条件:

    如采用宏基因组测序,可根据使用的研究材料(即待检样本)的情况,选择测序数据量。

    病毒载量在104 copies/ml以上或qPCR定量CT值<24.5的样本,推荐数据量为20Gb(PE100,100M reads);

    qPCR定量CT值在24.5——28.7范围的样本,推荐数据量为100Gb(PE100,500M reads)。

    对于病毒载量极低的样本(CT值>28.7),不建议使用宏基因组测序,可以采用多重PCR扩增子测序。

    如采用多重PCR扩增子测序,推荐数据量为5-20M。该方法也适用于病毒载量极低(<102copies/ml)的极端样本检测。

    注:推荐样本数据量仅供参考
    基于测序方法及样本病毒载量的测序数据量选择

    图3 基于测序方法及样本病毒载量的测序数据量选择

    测序读长

    如进行快速检测,可采用单端测序,推荐SE50/SE100读长,快速、经济;如需要进行病毒全长序列组装,建议使用双端测序,推荐PE100/PE150读长,测序数据质量高、Reads比对更好。
    测序读长选择

    图4 测序读长选择

    测序文库的处理

    针对病毒RNA测序,在文库制备过程中是否去除核糖体RNA(rRNA)也是一个值得探讨的问题。rRNA占总RNA的80%以上,去除人类rRNA可以提高有效数据利用率。同时也需要考虑样本情况:如果病毒核酸投入量低,以及放置时间久、降解严重的样本,去除rRNA可能会影响建库效果,可以选择不去rRNA,以提高建库成功率。

    测序平台的选择

    根据实验室样本规模,选择合适的测序平台。每个平台单次运行的样本数与测序方法、测序数据量相关。其中,宏基因组测序方法,一般以单个样本的数据通量>100M reads为参考;多重PCR扩增子测序方法,以单个样本的数据通量>5M reads为参考。

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