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常见问题

什么是荧光定量PCR相对定量

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2020-05-28

    什么是荧光定量PCR相对定量?本期讨论qPCR实验中的相对定量。相比绝对定量,相对定量在实际的科研工作中可能应用更广泛。

    相对定量特点

    从字面上来理解,相对定量就是“相对而言的量的关系”,它并不关注样本中含有的靶标的绝对数量,而更关注实验样本相对于对照样本的靶标的量的变化,通常用倍数关系来表示。常规的基因表达和拷贝数变异CNV实验就属于这个范畴,略有不同的是,CNV实验考量的是样本内靶标基因对内参基因的倍数关系。

    Normalizer

    同绝对定量一样,相对定量实验也需要normalizer,否则就不是同一个水平线上进行的比较。绝对定量用到的那些normalizer,在相对定量中一样可以使用。比如对照组使用了1000个细胞,靶标的Cq值是32;实验组使用了500个细胞,靶标的Cq值是30,假设扩增效率100%,那么实验组的相对表达量就是8(对照组是1)。实际上,相对定量中更常用到的normalizer是内参基因,比如大家常用的Gapdh,β-actin等。通常假定内参基因的表达量不受实验刺激因素的影响,然而,常常这个条件不能满足,或者不知道是否满足,这就给实验的准确性带来了很大挑战。目前,很多杂志都要求文章中用到的qPCR内参基因需要验证其表达稳定性,未来我会拿出一个专题来讨论这个问题。

    The 2-△△Cq(Livak) Method
    基因表达实验

    这大概是基因表达实验中用的最多的计算方法,最早由Livak等人于2001年提出[1]。尽管这是大家所熟知的公式,但还是有不少人对怎么减和减的先后顺序有所混淆。这里将文章中的推导过程做一展示(Fig 1),同时也是为了让大家了解这个公式的应用前提。

    Figure 1. 2-△△Cq公式的推导过程[1]

    首先计算的是最里面的△,这是经过normalization后的靶标的表达量,然后再计算外面的△,这是与对照样本对比的表达量倍数。推导过程中做出了靶标基因和内参基因的扩增效率都是100%的前提假设,但这一点在实验中往往并不容易满足,尤其是碰到复杂样本(如环境样本,FFPE样本等)时。实际中这个公式的应用条件可以适当放宽的,一般要求靶标基因和内参基因的扩增效率在90%-110%之间,且两者相差不能超过5%。如果这个条件不能满足,可以采用PfafflMethod。

    Pfaffl Method和Vandesomple Method

    PfafflMethod在靶标基因和内参基因效率相差较大时应用[2],推导过程类似,在此不做赘述。更进一步的,Vandesomple Method在同时有多个内参基因时进行校正,采用的normalizer是所有内参基因表达量的几何平均数[3]。当没有证据表明所用的内参基因是表达稳定的时,更推荐使用2-3个内参基因来做normalization,可以显著提升数据质量[4]。更多的内参基因可以使normalization过程的变异程度降到更低,数据的variation会更小(Fig 2)。
    重复性评估

    Figure 2. 采用不同数量的内参对C基因表达量进行day-to-day重复性评估[4].

    扩增效率

    很多人会问,相对定量还有必要做标准曲线吗?答案是肯定的。相信大家也可以看到,PfafflMethod和Livak Method的区别就是在于扩增效率,因此如果没有评估靶标和内参的扩增效率,也就无法做出选择。相对定量时做标准曲线要简单的多,并不需要有已知浓度的标准品,只需要将浓度相对较高的某个待测样本(可以小量预实验)每次稀释2-4倍,有4-5个梯度就可以对扩增效率进行比较准确的预估了。

    到本期,第一部分“qPCR的前世今生”的内容就告一段落了,希望大家可以对qPCR形成一个比较整体的认识,从来没有接触过的人觉得可以稍稍入门了,那我觉得这部分工作就没有白费。下一期进入第二部分“qPCR的标准化”,我们首先讨论取样的问题。
 

    参考文献
    1. Livak,Kenneth J., and Thomas D. Schmittgen. "Analysis of relative gene expressiondata using real-time quantitative PCR and the 2− ΔΔCT method." methods 25.4 (2001): 402-408.
    2.  Pfaffl,Michael W. "A new mathematical model for relative quantification inreal-time RT–PCR." Nucleic acids research 29.9 (2001): e45-e45.
    3.   Vandesompele,Jo, et al. "Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR databy geometric averaging of multiple internal control genes." Genome biology3.7 (2002): research0034-1.
    4.  Zmienko,Agnieszka, et al. "Selection of reference genes for qPCR-and ddPCR-basedanalyses of gene expression in senescing barley leaves." PLoS One 10.2(2015).

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