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常见问题

常见生殖道病原体核酸检测技术

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2020-05-24

    性传播疾病(STD)是主要通过性接触传播的一类泌尿生殖道感染性疾病,是现今大多数国家最普遍的感染性疾病。近年来,随着国家经济的发展,人际交流日趋频繁, 人口流动逐渐增加和性观念开放,STD 在我国感染率呈增长趋势,严重影响着人们的身心健康与生活质量。生殖道病原体主要包括解脲脲原体(Uu)、沙眼衣原体(CT)和淋病奈瑟菌(NG)三种。

    STD 感染常引起泌尿生殖道感染,女性患者常引起免疫缺陷、癌症、不孕、早产、死胎;男性患者可引起不育、附睾炎、前列腺炎等疾病。因此,定期进行检测STD,能及时反映本人STD 的感染情况,对制定STD 防治策略具有重要的指导意义。
    核酸检测技术

    在性传播疾病中, 淋球菌(NGH)、沙眼衣原体(CT)、解脲支原体(UU)较常见。大多数医院目前多采用病原体培养、免疫学检测或常规聚合酶链反应(PCR)等方法进行检测。培养虽然特异性较高, 但所需时间长, 而且有些病原体如UU 培养灵敏度较低。用免疫学方法检测病原体抗原灵敏度低, 约需要105 -107 个病原体才可检测到 。检测抗体一是存在“ 窗口期”问题, 同时不能判定是现症感染还是既往感染。常规PCR 虽简便、快捷, 但存在不能定量, 易交叉污染等缺点。

    目前市很多医院中心实验室引进了实时荧光定量PCR技术,取得了较好的效果。

    荧光定量PCR 原理:该技术在常规PCR 基础上,加入了一条用荧光基团标记的特异性探针。其探针5′端标记荧光报告基团, 3′端标记荧光抑制基团。两者构成能量传递结构, 即探针完整时, 抑制基团吸收或抑制了报告基团的荧光, 故检测不到荧光或荧光信号无改变。当有特异性PCR 扩增发生时, 在退火过程中, 探针与引物同时结合于模板上, 引物延伸时, 探针被Taq 酶的5′活性作用切断, 这时发生能量转移, 抑制基团的作用消失, 报告基团荧光信号增长, 被切断的荧光探针的量与被扩增的目的基因的量呈一一对应关系。因此, 荧光信号伴随着PCR 产物的增长而增长。实时定量荧光PCR 方法就是利用此原理, 在PCR 过程中, 连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化。当信号增强到某一阈值(根据荧光信号基线的平均值和平均标准差, 计算出99.7%的置信度大于平均值的荧光值, 即为阈值)时, 此时的循环次数(Ct 值)就被记录下来。该循环参数和PCR 体系中起始DNA 量的对数值之间有严格的线性关系。利用阳性梯度标准品的Ct 值制成标准曲线, 再根据样品的Ct 值就可以准确测定出起始DNA 拷贝数。

    因此,荧光定量PCR仪除了有快速、操作简便,不需对PCR 产物进行后处理, 从而防止了扩增产物污染等优点外,还具有定量范围宽、定量准确等优点。

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