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常见问题

非瘟防控中PCR实验室环境污染的监控措施有哪些

作者:admin   发布时间:2020-05-21

    随着非洲猪瘟(ASF)的来袭,国内荧光定量PCR实验室如雨后春笋般地快速发展。荧光定量PCR方法已成为ASF防控过程中最常见的手段。我们通过调查发现:随着检测量的增加,各实验室的环境污染问题日益突出。2019年初,仇华吉研究员多次在国内ASF防控会议上,从专家的角度呼吁大家在做ASF检测和监测时,务必要防止实验室本身所造成的污染问题。
    自此,如何建立实验室,如何防止实验室的污染问题也逐渐引起了大家的关注和重视!我们通过与诸多实验室共同地努力和不断地优化,逐步建立了一套荧光定量PCR实验室的环境污染监控和处理方法,分享给同行,供大家参考。
    关键词:PCR实验室  环境污染  监控系统
    SOP荧光定量PCR技术在国内兽医体系的大量应用,多半是为了防控非洲猪瘟(ASF)。所以很多实验室都是为了应对ASF疫情而仓促上马的,设计不合理、运行不规范,经常会出现实验室污染问题;而这些问题往往未能得到足够的重视,导致出现“阴性对照不成立、甚至出现假阳性”的错误结果。为有效地控制PCR实验室污染,我们通过对实验室的设计和布局、实验室环境污染监控体系的建立以及相关问题的处置、人员的培训等方面来提高PCR实验室检测水平。
    1.实验室的设计和布局
    1.1  关于PCR实验室的设计和布局
    PCR实验室设计的科学与合理是保证实验结果准确的必备条件。我们常见一些实验室由于在设计上的缺陷,导致实验室的环境污染难以去除,甚至不能再进行PCR检测或不愿意使用高敏感的试剂盒来检测(“鸵鸟策略”)!
    标准化的 PCR 实验室设计最主要考虑的两个方面:
    1、各区独立
    2、注意风向
    PCR实验室的分区我们按照污染程度来划分:可分为试剂准备区-核酸提取区- PCR扩增区,普通的PCR实验室还有产物分析区,其污染程度依次增大。PCR实验室各个相对独立的区域内要做好正负压的控制,简易的实验室可以安装不同数量的排风扇来实现不同区域的压差。严格分区还要注意实验室内的空气在不同区域的流向问题。我们要防止扩增产物顺空气气流进入上游扩增前的 “洁净” 区域。所以,实验室科学的通风设计在去除气溶胶污染方面是非常有帮助的!
    1.2  PCR实验室的设计中常见的一些错误
    我们参观和了解过许多实验室,发现有些PCR实验室的设计存在严重的问题。下面是一些常见的设计错误,希望能够引起大家的注意。
    (1)中央空调互通:这样就造成实验室各区域的互通,非常容易造成整个实验室的污染,进而不能使用。所以,需要在各区域另行安装分体式空调或者安装PCR实验室专用的分区通风系统。
    (2)隔断不密封:有些实验室在分区设计时,只是考虑实验室在形式上的分区(各区分割不完全,有相通之处;各区之间无缓冲间;或者即便有缓冲间,却在装修时采用家庭装修模式——吊轨式推拉门或者平开门,门的下面留有缝隙等等)。
    (3)传递窗不密封:如果传递窗不密封,虽然有时方便了试剂、物品在不同实验区间的传递,但同时也增加了交叉污染的风险。一个合格的传递窗应是双开门且密封严实,并且两边的门最好设置连锁装置控制(即一次只能开启一扇门)。此外,传递窗内应配有紫外灯照射装置,并在每次使用后立即进行照射。
    2.实验室环境污染的监控体系建立以及相关问题的处置方法
    2.1  PCR实验室环境污染监控的重点
    PCR实验室环境污染监控和猪场环境监控的关注点是不一样的。在实验室层面,主要是关注产物和气溶胶的核酸污染问题;而在猪场,则关注对病毒污染的监测。所以,我们对于PCR实验室的监测关注点在重点区域和关键仪器设备方面。
    下面是对PCR实验室划分的监测重点区域和关键的仪器耗材:
    实验区域:按区域采样:试剂准备区、核酸提取区、 PCR 扩增区。采样重点是在操作台面和控制按钮、冰箱门把手、离心机、枪头盒盖等。
    仪器耗材:移液枪、离心机、涡旋振荡器、核酸提取仪、PCR仪等。
    2.2  PCR实验室的环境采样
    实验室环境采样需要使用专用拭子(一般长度在10-15cm,易折断为佳)。使用时将它浸入装有350-500微升PCR级水的1.5ml离心管中,然后将拭子在离心管壁上适度挤压,去除多余的水。注意:在不同区域采样时需更换拭子。
    (1)将拭子在长约30cm的取样区域旋转擦拭2-3次(台面或离心机内表面)。然后将拭子放回离心管,涡旋震荡10-15秒,洗脱拭子上捕获的核酸。
    (2)按上述方法去除拭子上的水,剩下液体作为检测样品。具体采样检测操作如下图所示:
    2.3  PCR实验室气溶胶污染的监控
    气溶胶污染的监控主要针对超净工作台和生物安全柜:可以采用空气采样方式。
    (1)将6-8层纱布,其面积为30cm*30cm,用PCR级水或无核酸残留的纯净水浸润,打开风机,将其放在出风口5-10分钟后取出。将纱布放在带盖的塑料离心管内,涡旋振荡10-15秒,洗脱纱布上捕获的核酸。
    (2)或者,将装有30-50微升PCR级水的1.5ml离心管,敞开盖放置在不同的监测区域12-24小时采样,然后进行检测。
    2.4  PCR实验室环境监控频率
    我们可以根据实验室不同的等级划分和检测样本的情况,建议采取如下三种频率进行:
    (1)一般实验室监控频率可以按照: 每周或每两周监测1次进行。【基层实验室】
    (2)检测样本非常频繁,需要增加监控频率:每周监控1-2次。【集团中心实验室】
    (3)国家参考实验室:要求每天必须进行实验室环境监控。【专业参考实验室】
    2.5  PCR实验室环境监控配套试剂
    PCR实验室环境污染的监控需要配备专门的配套检测试剂。IDEXX可以提供各PCR实验室环境监测所需要的相关产品,帮助大家更专业地评估和及时发现实验室可能存在的污染问题。
    (1)IDEXX RealPCR™ ASFV DNA Mix
    (2)IDEXX RealPCR™ PC DNA Tracker(阳性对照追踪DNA检测混合液)
    (3)IDEXX RealPCR™ Signal Check(QC细菌DNA检测混合液)
    实验室环境监控方案
    * 根据具体实验室检测内容来确定(ASFV、PRRSV、PEDV、CSFV ……)
    实验室环境监控结果解读
    * 根据具体实验室检测内容来确定(ASFV、PRRSV、PEDV、CSFV ……)
    2.6  PCR实验室环境污染处理措施
    【方法一】将84消毒液配置成最终有效氯浓度为2000 mg/L的溶液,对重点污染区进行擦拭;孵育5分钟后,用洁净的纸巾擦拭干净,再用清水或75%酒精进行两遍清洗。
    【方法二】使用商品化核酸清除试剂(如DNAZap、DNAOff或DNAAway)进行处理。使用时直接将商品化试剂喷涂于需要处理的区域,孵育5分钟后用洁净纸巾擦拭干净后,再用清水或75%酒精进行两遍清洗。同时建议配合房间的紫外灯和移动紫外灯(照射高度30-50 cm)对重点污染区、离心机、PCR仪等进行照射。建议消毒完后再进行各房间的通风。
    2.7  PCR实验室高风险污染区域的处理方法移液枪:
    单按钮移液枪:缓慢匀速移液。各区的移液枪要单独使用且应有各自的标识;使用后,移液枪锥嘴处及表面用75%酒精溶液清洁。若使用过程中发生污染,应及时对移液枪咀使用75%酒精浸泡15分钟左右。可考虑使用Eppendorf R-II移液枪(防止气溶胶污染)。
    离心机:每次实验开始前,用75%的酒精擦拭离心机(外表、转子及内壁)。每次实验完毕后,先用84消毒液浸泡过的软布擦洗离心机,再用洁净的湿布擦洗,待干后盖上机盖。每月使用中性去污剂清洁转子与离心室(打开离心机盖,拨掉电源线,用专用设备将离心机转子旋下)。
    qPCR仪器:定期清洁热盖和反应槽。具体方法:关机后,将反应槽取出,打开热盖,用95%酒精或异丙醇浸透的棉棒擦拭反应孔(逐孔擦拭,污染严重时需逐孔更换擦拭所用的棉棒)和热盖,待酒精或异丙醇挥发后再将反应槽安装好,将热盖恢复原位。若发生污染严重时则改用中性消毒液,按上述步骤消毒,然后再用95%酒精或异丙醇擦拭。
    注意:实验室环境监控出现污染并处理后,仍需要对处理后的效果进行二次评估,确定没有污染后才可以进行实验。
    3.实验室人员的培训
    PCR实验室人员必需具有专业的素养,必需对实验室检测、监测方面非常清晰和了解,定期进行回顾和培训。建立标准的SOP以及实验室各种规章、制度等。
    4.实验室规范化操作流程(赵俊娜)
    建立PCR实验室规范化操作流程(SOP)非常重要!我们只有建立了良好的PCR实验操作规范,才能有效降低实验室环境的污染的发生,使我们的检测结果更为准确!
    4.1  实验前:准备工作
    (1)进不同区域要换不同的拖鞋、穿不同的工作服,戴上手套、口罩等。
    (2)每日检测前开启紫外灯和移动紫外灯:距离台面30-50cm照射30-60分钟。
    (3)开启排风柜,保证检测区域空气单向流动。
    (4)试剂、耗材的准备:特别是在装枪头的时候必需戴一双全新的手套。
    (5)标记好样本。
    4.2  实验中:减少试剂、器具被污染的风险
    (1)样品的处理:按照规程处理样本;试剂在前,样本在后。
    (2)最好使用带滤芯的枪头(防止气溶胶的污染)。
    (3)开管盖时需防止液体接触到手套;操作全程注意防止液体的飞溅和洒出。
    (4)加样顺序:阴性对照、待检样本、阳性对照(不建议使用高浓度核酸或质粒作为阳性对照)。
    (5)保存数据,清理废弃物。
    4.3  实验后:及时清理,保证环境洁净
    (1)将吸头、离心管、PCR产物等用消毒液浸泡处理。手套、口罩、鞋套丢弃于指定垃圾桶。若条件允许,则将废弃物与样品一同焚烧处理;或者与第三方合作处理。
    (2)用84消毒液(按照有效氯2000mg/L浓度,现配现用)擦拭移液枪、仪器(注意PCR仪等属于精密仪器,不建议使用84消毒液)、台面等,作用后再用清水擦拭干净,紫外灯照射。
    依次清洁各区的实验台面和地面。各区清洁消毒工具均为专用。注意按照单一方向流程的原则进行清洁。
    结论
    非瘟防控,实验担当!在非猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测过程中,实验室的检测、监测起到了非常重要的作用!我们通过PCR实验室科学的设计和布局、关注通风和风向、定期进行环境污染的监控和处置,能大幅度降低PCR实验室的污染,增加检测结果的准确性,从而为实验室人员树立信心。同时,注意实验室操作人员专业化的培训以及PCR实验室人员规范化的操作,对于获取准确的实验室结果也非常重要!

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