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常见问题

如何设计兽医检测荧光定量PCR实验?

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2020-05-21

    实时荧光定量PCR技术(real-time fluorescent quantitative PCR,后文简称qPCR)作为目前核酸检测和定量中最主要的分子生物学工具之一,以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高、速度快等多个优点在疾病快速检测、食品安全检测、靶向用药基因检测等多种应用领域中一直发挥着巨大的作用。

    自2018年8月起,国内爆发非洲猪瘟疫情,非洲猪瘟具有多种表现形式,最常见的是急性发病形式,相关致死率高达 100%。非洲猪瘟严重威胁着养猪业的健康生产和相关供应链的发展,但目前还不存在有效的疫苗或治疗方法,专业人员意识到仅靠传统的临床症状判断,并不能有效的控制疫情,人们的目光越来越多的集中到了具有准确、灵敏、快速等优势的实时荧光定量PCR技术。
    实时荧光定量PCR技术

    qPCR作为一项成熟的实验技术,实验操作看起来也并不复杂,但知易行难,如何保证得到的检测结果是真实有效的呢?这对于动物疾病检测是至关重要的。俗话说,好的开始是成功的一半,成功的实时荧光定量PCR 设计和开发是获取准确检测数据的基础。

    一个成功的qPCR结果应该是稳定、可重复、准确、灵敏度高且特异性强。我们看到的最终qPCR结果是多个实验要素综合的输出,荧光定量pcr实验步骤中所有的实验要素对于实验成功缺一不可。qPCR实验由这些相关要素组成:样本、标准品、实验对照、误差校准、试剂选择。

    由于涉及点比较多,限于篇幅我们仅挑取两个点展开讨论。

    实验对照在很多时候并不被重视,因为大家往往会觉得对照并不必要,而且会增加实验成本。但从长远来看,所有的实验对照都是为了确保得到的实验结果是真实的。如果没有合理的对照,实验有效性将无法保证,并且在出问题的时候很难进行故障排除。

    实验对照可以分为两大类,一类是阳性对照,主要用于排除假阴性结果的干扰;一类是阴性对照,主要是用于排除假阳性结果导致的误判。

    01.阳性对照

    阳性对照可以监控反应体系中是否存在PCR抑制物,及反应系统 (包括试剂、PCR程序、荧光采集)是否正常。可以分为两类内部阳性对照和外部阳性对照。内部阳性对照常规的选择是内参基因,但在很多情况下,选择合适的内参基因并非易事,这时通过引入外部阳性对照,可以起到同样的监控作用。一个合适的外部阳性对照应该可以整合进任意的实验设计中,且不会与待检样本的核酸序列产生交叉反应,同时不会成为检测位点的竞争抑制剂。我司的VetMAX Xeno IPC经美国兽医实验诊断协会验证,与现有GeneBank上任何物种无交叉反应,兼容多种类型及多重检测的实验需求。
    阳性对照

    02.阴性对照

    阴性对照可以进一步细分为无模板的阴性对照 (No Template Control,NTC)、阴性样品的对照 (Negative Sample Control,NSC)以及如果模板是RNA的话,还有一种未经反转录的对照(No Reverse transcript Control)。无模板的阴性对照是在反应体系中不加入核酸模板,而以水为替代的对照,主要用于监控配置反应体系中的相关组分是否存在污染;阴性样品的对照则是在样本提取过程中,用已知的阴性样本或者水作为样本进行提取,并将得到的提取物作为模板同样进行qPCR检测,可以监控整个实验操作过程中是否存在污染。

    当检测模板是RNA的话,还需要先进行一步反转录得到cDNA之后才能进行后续qPCR反应。若是模板不纯,混有基因组DNA可能会干扰后续结果,这时从未经反转录的对照的结果就能有效判断扩增信号是来自合成的cDNA还是基因组DNA。

    实验污染防治

    与传统PCR一样,实时荧光定量PCR反应也容易受到核酸污染,从而导致假阳性结果。上面我们提到了阴性对照可以帮助监控体系和实验过程中是否存在污染。如果发现污染,接来下就是找到污染源并清除它。qPCR可能的污染源有:样本间的交叉污染、实验室设备的污染、前次PCR扩增产物和引物残余污染。这是假阳性PCR结果的主要来源

    前两种污染可以通过严格规范的实验操作有效清除,比如严格分区实验室及严格遵守工作程序;进行合理的化学清污,如使用10%的次氯酸钠清洗实验台面,然后再用70%乙醇或清水洗去次氯酸钠;或者通过紫外线(UV)照射,每次实验前可将实验台面照射5——20分钟,来消除扩增产物遗留污染。当以上方法都无法有效去除污染时,还可以使用 DNAZap™ PCR DNA 降解试剂,完全降解PCR灵敏度水平上的污染核酸。

    但对于第三种污染,也是实验中的主要污染源,以上这些方法就显得有心无力了。针对第三种污染,可以采用尿嘧啶DNA糖苷酶(简称UNG酶)或者尿嘧啶DNA糖基化酶(简称UDG酶)来预防这类污染。UNG/UDG酶会选择性水解断裂含有dU的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键,形成碱基缺失的DNA链。这些缺失碱基的DNA链在碱性介质以及高温下会被进一步水解断裂,最终被消除。UNG/UDG防止qPCR中残余污染源于在qPCR预混液中用dUTP替代dTTP。在PCR扩增前,先用UNG/UDG处理后续的实时荧光定量PCR 反应预混液,降解其中污染的含有尿嘧啶的PCR产物,保留天然 (含有胸腺嘧啶) 的靶DNA模板用于后续的PCR扩增。赛默飞绝大部分的qPCR预混液中都加入了UNG/UDG酶,有效的控制DNA残余污染对实验结果的干扰。

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