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常见问题

荧光定量PCR引物的设计原则与方法primer3plus

作者:解螺旋   发布时间:2020-05-18

    实时荧光定量PCR是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。

    实时荧光定量PCR是实验室最常用的实验。研究基因在mRNA表达水平,以及验证基因敲除后下游靶基因变化情况等等。对于新手来说,如何利用primer3plus快速设计引物呢?

    首先,推荐三个在线设计实时荧光定量PCR引物的网站,不用安装软件,直接上网就可搞定。

    一、Primerbank

    1.  首先进入网站主页,https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/。选择Keyword,根据自己需求选择种属以及基因名称。比如设计人类BCL2基因。
    Primerbank

    2.点击submit后可以看到以下界面,网站会推荐多对引物,可以根据引物长度、Tm值选择。
    点击submit

    二、Pubmed

    1. 在Pubmed网站找到BCL2基因组序列,点击FASTA获得基因序列后,将基因序列下载到桌面上。
    点击FASTA

    2.点开pubmed主页上面的Blast,进入Primer-BLAST, 输入基因序列,可以根据自己实验要求选择引物长度。
    选择引物长度
    选择引物长度

    3.点击Get primer之后,可以得到多对引物序列。可以根据引物长度等要求进行筛选。

    三、Primerplus3

    1.在Pubmed-gene获得基因序列后,在primer3plus主页上输入基因序列,网址; http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi。
    输入基因序列

    2.点击general setting,设置引物扩增长度,一般可设置扩增长度偏大一些,然后根据推荐引物选取合适扩增长度。
    设置引物扩增长度

    3. 点击pick primers后,首先会看到优选推荐的一对引物,同时在序列中看到引物所在位置。Primer3plus网站中可以看到引物Tm值以及GC含量。
    引物所在位置

    最后简单介绍一下实时荧光定量PCR引物设计原则:

    (1)引物长度一般在15——30碱基之间,过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于TaqDNA聚合酶进行反应。

    (2)引物GC含量在40%——60%之间,Tm值最好接近72℃。引物的Tm值是寡核苷酸的解链温度,一般计算公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值。

    (3)引物应具有特异性。引物设计完成以后,应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性,就可以进行下一步的实验了。

    (4)引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹结构使引物本身复性。

    (5)引物扩增长度:一般RT-PCR引物扩增长度在100-200bp。

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