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常见问题

荧光定量PCR实验过程中的常见问题与解决办法

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2020-05-15

    荧光定量PCR是目前分子生物学研究中最常使用的技术手段之一,但很多初学者在做荧光定量PCR实验时都会遇到一些问题,为了更好地指导研究生的实验教学,结合我们实验室的经验,我们整理了8个常见问题与解决方案。
    荧光定量PCR问题汇总

    一、什么样的试剂盒性能较好?

    性能较好的试剂盒熔解曲线出现单一峰,扩增特异性高,扩增“S”型曲线典型,CT值较早出现。目前Roche、ABI、Biog等的试剂盒性能都不错,反应特异性高,有效避免非特异扩增,提高实验效率。

   二、熔解曲线出现多峰是什么原因?怎么解决?

    较为理想的熔解曲线是单峰曲线,如出现多峰有以下原因:

    1)非特异性扩增:主要原因为引物特异性不好、Tm值较低或模板质量不高,可以根据设计原则设计新引物或者通过梯度 PCR 对引物退火温度(Tm值)进行优化,上调Tm值,选购质量较好的离心柱法核酸提取试剂,提高核酸提取质量,等等。

    2)引物二聚体 可通过琼脂糖凝胶电泳确认引物二聚体。引物二聚体在凝胶的底部形成扩散条带,通常位于100 bp以下。引物二聚体在熔解曲线内峰值一般位于75℃左右,如该峰显著请按照以下方面进行优化:

    A.优化扩增条件,如提高退火温度,可利用梯度PCR,摸索最佳的Tm值。通常两步循环(由 95℃变性步骤直接进入 60℃退火和延伸步骤) 有利于强效扩增,因此引物设计时设定的成功退火温度为 60℃。

    B.引物浓度太高,适当降低引物浓度。通常引物的Tm低于目的基因,熔解曲线上峰值在目的基因峰的左边。大多数情况下,每条引物的理想最终浓度为200 nM,但如有需要,可将浓度降至60nM。

    C.cDNA模板带有基因组DNA污染:重新制备cDNA模板。在RNA提取完成后加入DNase对RNA进行处理,然后逆转录为cDNA。

    如果排除以上原因还是出现熔解曲线多峰的情况,就要考虑及时更换试剂盒,避免耽误实验进度。

    三、扩增曲线形状异常,如“S”型曲线

    反应体系引起的扩增曲线不光滑---扩增效率偏差(过高或过低)

    A.扩增效率过高

    出现非特异扩增或引物二聚体:反应体系内模板浓度太高以及模板核酸质量较差,可能导致出现抑制PCR反应的现象。在绝对定量时表现扩增效率大于110%。

    解决方案:去除模板浓度最高的反应孔并重新分析标准曲线;对目的基因做标准曲线,一般用质粒做梯度稀释,或用PCR产物做梯度稀释,然后做定量扩增,通过曲线评估反应效率。绝对定量有效的扩增效率在 90%-110%;重新纯化模板,去除模板中存在的潜在抑制物。

    B.扩增效率过低

    扩增效率过低主要表现在试剂浓度不适(主要是引物、镁和Taq DNA聚合酶,尤其是在多重实验中),引物对Tm之间的差异超过5°C以及热循环条件不适,试管中各种同源物质的竞争作用可造成反应效率低下。绝对定量表现:扩增效率<90%。

    解决方案:对上述因素逐一排除后进行调整优化实验体系或选用Biog、ABI等质量比较稳定的试剂盒。

    C.个别扩增曲线异常

    如个别扩增曲线突然骤降:反应管内留有气泡,由于温度升高后气泡破裂,使仪器检测到的荧光值突然降低所致。进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。

    仪器设置不当引起的曲线异常:基线设置不当,如扩增曲线断裂或下滑:基线的终点值大于Ct值。减小基线终点 (Ct 值- 4),重新分析数据。

    Rox添加不当:表现为扩增曲线呈锯齿状且不连续,需校正参比染料。

    四、Ct值出现太晚

    扩增效率极低:优化反应条件,尝试三步法扩增程序,或者重新设计引物;

    模板浓度太低:减少稀释度重复实验;

    模板降解:重新制备模板,重复实验;

    PCR产物太长:一般将PCR产物长度设计为100 bp-150 bp之内;

    反应体系中存在PCR反应抑制剂:一般为加入模板时带入,模板质量不高,加大模板稀释倍数或者重新制备模板重复实验。在排除以上原因并优化实验之后还是不能取得理想CT值时,就要考虑试剂盒的问题了,可以换用Biog、Roche、ABI等的试剂盒,扩增效率较高,较早出现CT值。如进行多重PCR实验,最好选用专门的多重PCR试剂盒,如BIOG多重定量PCR试剂盒。如选用一般的定量PCR试剂盒,就会出现扩增曲线不典型,CT值较大甚至扩增失败等。

    五、阴性对照也出现明显扩增

    反应体系组分(如,水)被污染:实验过程中,更换新的Mix或者水重复实验;标本间的交叉污染或产物污染:反应体系在超净工作台内配制,对实验室进行严格的区分,减少气溶胶污染;使用带滤芯的枪头;引物二聚体的出现:一般在35循环以后阴性对照出现扩增属正常情况,可配合熔解曲线,PCR产物的琼脂糖电泳结果进行分析。

    六、绝对定量和相对定量的差别?

    绝对定量目的是测定目的基因在样本中的分子数目,即通常所说的拷贝数,应用于taqman探针法检测。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例,而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数,应用于sybr green染料法检测。

    七、绝对定量时标准曲线线性关系不佳

    加样误差:加大模板稀释倍数,提高加样体积;

    标准品降解:重新制备标准品,重复实验;

    模板浓度太高:增加模板稀释倍数。

    八、反应结束无扩增曲线出现

    扩增效率问题:电泳检测qPCR反应产物,观察是否有目的条带出现。如果没有,则需要逐一排查引物、模板以及反应条件问题;确认引物是否降解:长时间未用的引物应先通过 PAGE 电泳检测完整性,以排除引物降解的可能性;模板浓度太低或目标基因表达丰度过低:减少稀释度,重复实验,一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。

    通常基因表达检测所需的cDNA量为1-100ng。如样本中目的基因丰度很低,就需要更多的样本量。如果对期望的表达水平不是很确定,可重新查询文献或 NCBI Unigene数据库中EST表达数据来预估在不同组织中的表达水平;模板降解:重新制备模板,重复实验;逆转录问题:与低表达量相关,如果目的基因在样本中的丰度很低,需要增加实验的灵敏度。确认一下qPCR反应中没有加入过量的cDNA (最大加样水平为 20% v/v),因为过量的cDNA样本会引入抑制剂降低反应效率。也可以检查一下逆转录酶和引物。随机引物通常比基于oligo(dT) 的方法产生更多的 cDNA。另外,有些逆转录酶经过热稳定性改造,也会提高cDNA产量。

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