目的基因的扩增,聚合酶链式反应PCR原理与过程

作者：荧光定量PCR仪   发布时间：2020-05-26

    一、聚合酶链式反应的基本过程

    聚合酶链式反应（PCR）是通过PCR仪，模拟DNA半保留复制，从而体外快速扩增DNA的方式。生物实验室要用到PCR的地方……简直数不胜数。比如扩基因、检测、吃螺师粉儿（什么鬼……）等等。

    典型的PCR包括高温变性、低温退火、中温延伸三个步骤，通过将这一套过程不断循环，使DNA得以成百万倍的扩增。当然这是典型的……不典型的PCR五花八门，等以后用到再跟大家分享( °△ °|||)。

    因此所谓的PCR仪，其实就是一套自动温控系统，早先人们做PCR都是用水浴锅来做，指甲盖大小的离心管，在三个锅子里来回倒来倒去，拼个手速，攒个人品，好不热闹。这么想想，其实现在实验室还是蛮幸福的。

    高温变性：所谓变性是95℃左右时DNA双链打开的过程，使之能够与引物结合，为下面的反应做准备。但是注意考点：这里的DNA不只是我们加进去的模板DNA，还包括扩增出来的DNA，体系里但凡是双链，高温都能给他打开了。这个过程大约需要5 min左右，再长就煮熟了。

    低温退火：退火是个很亲切的词，这是我们做无机非金属里面的概念，不知道是哪位巨巨给引入了生物学。所谓退火就是适宜条件下冷却的过程，上面说到DNA高温变性，变性后的单链与引物通过碱基互补配对，再次形成局部双链。更准确的来讲应该叫复性，恢复双链的过程。

    中温延伸：模板-引物接头之后，对你没看错，人家就叫接头，浓浓的社会气息。延伸就是在72℃、TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料，以靶向序列为模板，碱基互补配对为原则，再次合成完整的双链DNA的过程。我们可以看到这里复制之后实际上有一条链是新合成的，另一条则是原先就存在的，因此说这叫半保留复制。
    

    二、聚合酶链式反应的组成成分

    1.模板（1 ng/μL）

    模板DNA可以从各种生物组织中得到，通常浓度为1 ng/μL。浓度不是越高越好，浓度太高会导致大量的非特异性结合。

    2.引物（10 μmol/L）

    引物浓度通常是10 μmol/L。

    引物浓度太低，产量较低；

    引物浓度太高，引起错配、非特异性以及引物二聚体。

    一般都是商用的合成好之后直接用就好。

    3.Taq酶（5 U/μL）

    U是酶活力单位，定义为：25℃下（其它为最适条件），1分钟内能转化1 μmol底物的酶含量，或是转化底物中1 μmol有关基团的酶含量。

    4.dNTP（2.5 mmol/L）

    dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，从而影响DNA聚合酶的活性。

    5.Buffer（含Mg2+）

    Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。

    Mg2+浓度过低会使DNA聚合酶活性降低，PCR产量下降。

    Mg2+浓度过高会使特异性降低。

    三、聚合酶链式反应的体系

    

    四、聚合酶链式反应的结果

    琼脂糖凝胶电泳检测以大肠杆菌碱性磷酸酶（AKP）为例，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如下。