猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法

作者：荧光定量PCR仪   发布时间：2020-05-11

    猪瘟病毒(classicalswinefevervirus,CSFV)属于黄病毒科瘟病毒属,是猪的一种重要传染性疾病病原,猪是本病的唯一宿主,病猪和带毒猪是最主要的传染源,直接接触是病毒传播的主要方式。猪瘟发病特征为发病急,高热稽留和细小血管壁变性,引起全身广泛性小点出血,脾梗死,具有很高的发病率和死亡率,对养猪业造成了严重的经济损失,被世界动物卫生组织列为A类传染病,是国际贸易重要检疫对象之一(Meuwissen等,1999)。

    目前,CSFV的检测方法主要有3大类,即兔体交叉免疫试验、基于病毒抗原和抗体反应的血清学诊断方法和针对病毒核酸检测的PCR技术(梁仕岩等,2009)。兔体交叉免疫试验和血清学诊断方法检测病毒抗原虽然具有一定的灵敏度,但是操作繁琐,周期较长。PCR可以检测血液、粪便、分泌物中CS FV的核酸,实现早期诊断,在CSFV的检测中发挥重要的作用(傅烈振等,1998;张朝红等,2007;刘建柱等,2003)。近年来发展起来的实时荧光定量PCR检测技术将PCR与荧光检测结合起来,克服了传统PCR的假阳性和不能准确定量等弊端,可对样本中的核酸进行准确的定量检测,具有操作简单、结果直观、准确定量等优点,已经成为病原体检测的有效技术。

    1.1.1 毒株 猪瘟兔化弱毒疫苗为广西兽医研究所实验室保存。

    1.1.2 主要仪器和试剂 iCycleriQ荧光定量PCR仪(美国Bio Rad公司)、PCR仪(日本TaKa Ra公司)、凝胶成像系统(美国AlphaInotech公司)、生物分光光度计(德国Eppendorf公司)。RealMasterMix荧光定量PCR试剂盒(SYBR)购自天根生化科技有限公司,DNA胶回收试剂盒、质粒小量抽提试剂盒购自广州某生物科技有限公司,pMD18 T载体、RNA酶抑制剂(40U/ L)购自大连宝生物公司。Trizol购自美国Invitrogen公司,MLV反转录酶(5U/ L)为美国Promega公司产品。1.2 方法

    1.2.1 引物的设计与合成 根据GenBank公布的25株CSFV基因组5 非编码区基因序列进行同源性比较分析,选择保守序列区作为扩增区域,利用Oligo6.0引物设计软件和BLAST软件程序设计,TM序列为:CSFV 1:5 GCCCATAGTAGGACTAG CA 3 ;CSFV 2:5 CGAACTACTGACGACTGTC 3 ,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。1.2.2 病毒RNA提取和反转录 CSFVRNA的提取按照Invitrogen公司的Trizol提取说明进行。按李军等(2005)介绍的方法进行反转录。1.2.3 实时荧光定量PCR条件的优化 在iCy cleriQTM荧光定量PCR仪上进行扩增和数据分析,对不同退火温度(55——59 )进行优化,然后,以优化的退火温度分别对不同引物浓度(2.5、5、25pmol/ L)进行优化,确定其最佳引物浓度。1.2.4 熔解曲线分析 为排除非特异性扩增和引物二聚体的形成对实时荧光定量PCR结果造成影响的可能性,在PCR后进行熔解曲线分析以确定引物的特异性和所得产物是否为目的产物。温度以0.5 /10s的速率从55 缓慢递增到94 ,连续测定样品的荧光强度以获取熔解曲线。反应结束后取6 L产物进行电泳,判断有无96bp的特异性条带出现。

    1.2.5 标准品的制备和标准曲线的建立 以优化的反应条件对CSFVRNA反转录的cDNA进行常规PCR扩增。PCR产物经3%琼脂糖凝胶电泳,GelRed染色,凝胶成像系统检测,在紫外灯下切取目的片段,利用DNA胶回收试剂盒回收纯化目的片段。将回收纯化的目的片段与pMD18 T载体连接,转化大肠杆菌DH5 ,用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒,经酶切和PCR鉴定后,将阳性重组质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。纯化阳性重组质粒,测D260nm值后,将阳性重组质粒进行10倍梯度稀释,采用优化的反应条件进行实时荧光定量PCR,循环阈值(Ct)设定原则为超过阴性对照扩增曲线(无规则噪音线)的最高点。Ct值>35为阴性,Ct值<35为阳性。荧光定量PCR仪会根据各个标准品测得的Ct值,以样本拷贝数的对数为横坐标,以Ct值为纵坐标建立标准曲线。

    1.2.6 特异性、准确性和稳定性试验 分别提取CSFV、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型共4种病毒的核酸,用优化的反应条件进行荧光定量PCR,检测本方法的特异性。分别重复6次检测含量为2.0 106、2.0 105和2.0 10拷贝/ L的CSFV阳性重组质粒,评价本方法的准确性和稳定性。

    1.2.7 实时荧光定量RT PCR的临床应用 应用4

    的15份样本中,有6份样本经兔体交叉免疫试验证实为猪瘟病毒阳性。2 结果

    2.1 荧光定量PCR条件的优化 分别对退火温度和引物浓度进行优化,获得了CSFV的荧光定量PCR最佳反应条件和体系。总反应体系为25 L,其中RealMasterMix11 L、上下游引物(5pmol/ L)各0.5 L、cDNA模板2.5 L以及ddH2O10.5 L。反应条件:95 预变性5min;随后进行40个95 20s,57 20s,68 20s的循环;最后68 延伸5min。

    2.2 熔解曲线分析 熔解曲线只有1个特异峰(图1),排除了非特异性产物和引物二聚体形成对结果带来影响的可能,同时说明设计的引物具有很好的特异性,PCR反应条件得到了很好的优化。PCR产物电泳结果显示为单一条带,大小与预期扩增片段大小一致(图2),可以判断PCR为特异性扩增。

    2.3 标准品的制备和标准曲线的建立 CSFVRNA经反转录合成cDNA后,进行PCR扩增,PCR产物经胶回收后,与pMD18 T载体连接,转化大肠杆菌DH5 ,用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒,测序结果表明扩增序列与参考序列一致。抽提阳性重组质粒,测D260nm值。根据分子质量及阿佛加德罗常数(6.023 1023分子数/mol)换算为分子拷贝数,按2 1010拷贝/ L浓度的阳性重组质粒进行10倍梯度稀释,采用优化的反应条件进行实时荧光定量PCR扩增(图3),当模板浓度为2 10拷贝/ L时,仍有荧光曲线,表明该方法检测灵敏度为2 102拷贝/ L

    其结果与兔体交叉免疫试验一致。同时利用其它猪瘟病毒特异性诊断引物对这15份临床样本进行了RT PCR检测,其结果也与实时荧光定量RT PCR的结果完全一致,说明荧光定量RT PCR的准确性达到100%(廖素环等,2005)。
    

    荧光定量PCR的检测方法有二种,一种是以TaqMan探针为代表的杂交探针检测,另一种是以SYBRGreen 为代表的染料检测(Bhudevi等,2001;Mart nez等,2008)。SYBRGreen 染料可以与双链DNA的小沟结合,在波长497nm下发射荧光信号,而且荧光强度的增加与双链DNA的数量成正比,而未与双链DNA结合的SYBRGreen 染料分子不会发射荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步,达到实时定量的目的。与普通PCR相比,SYBRGreen 荧光定量PCR的核酸扩增和检测都在同一管内进行,无需电泳检测PCR产物,解决了PCR假阳性和核酸染料溴化乙锭对环境的污染问题。整个检测过程可在1h内完成,仅为普通PCR检测时间的一半,从病料到结果检测只需2.5h,能满足临床上猪瘟诊断的快速要求。与杂交探针荧光定量PCR相比,SYBRGreen 染料可以适用于任何基因的PCR扩增,无需设计特定的探针序列,价格成本低廉。

    由于SYBRGreen 染料与双链DNA结合没有特异性,容易产生非特异性扩增,因此需要优化PCR反应条件和得到单一的熔解曲线来增强检测的灵敏度和精确度(Simpson等,2000)。本试验通过优化PCR反应条件,在PCR退火温度为57 ,引物浓度为5pmol/ L时,获得的熔解曲线只有一个特异峰,表明了该反应为特异性扩增,没有引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物的出现。 荧光定量PCR的灵敏度检测结果表明,本试验建立的方法最小检出量为2 10病毒基因组拷贝数/ L。在特异性试验中该方法与猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型等常见的猪源病毒不存在交叉反应,说明本方法特异性强。对标准品分别重复6次检测,结果表明该检测方法具有良好的准确性和稳定性。将该方法用于临床样本的检测,其结果与兔体交叉免疫试验的结果一致。因此,本试验建立的具有高灵敏度和高特异性的荧光定量RT PCR检测方法能为猪瘟实验室快速诊断和疫情监测提供一种快速、准确、简便的检测。
文章作者：李军,潘艳,禤雄标,胡帅,马春霞,谢宇舟,陈泽祥,许力干,谢永平,杨威