荧光定量PCR实验需要注意哪些问题？

作者：荧光定量PCR仪   发布时间：2021-11-04

    1、 高产量，特异和灵活的定量PCR试剂体系

    影响PCR的因素如此之多，您有时很难区分是什么导致您的实验结果不佳。降低实验的不稳定因素是使用优质可靠的产品。

    使用优质、性能可靠的热启动酶、优质的dNTP、Mg离子、UNG/dUTP防污染系统预混成的定量PCR试剂体系，最大程度的降低了反应变量，提高了实验的可重复性和可靠性。您还需要进行以下步骤的准备：设计引物和探针、合成引物和探针、正确储藏、得到高质量的模板，随后，您仅需要进行退火温度的优化，就能得到好的实验结果。

    FQ PCR  MASTER Mix-UDG（hot start）同竞争对手的定量PCR体系相比提供了更优异的结果。使用这种产品，您可以在您的PCR中得到更好特异性和更高的灵敏度，同时可以灵活地选择您所喜欢的扩增条件，pcr检测方法和设备。

    实时定量PCR是快速增长的PCR方法，它可以精确、可重复地定量起始物质。FQ PCR  MASTER Mix-UDG（hot start）是一种方便使用的反应混合液，为定量分析进行了优化。它包含了荧光PCR所必须的成分（如缓冲液，dNTP，聚合酶）。只需加入您的模板，扩增引物和荧光标记探针。您就可以得到实时qPCR所需的特异性和灵活性。

    您可以利用成套的hot start Taq酶 kit(A2010A0106)，来配制不含有UNG/dUTP防污染系统的热启动荧光PCR体系。

    您也可以选择hot start Taq酶，UNG酶和dNTPS,来配制含有UNG/dUTP防污染系统的热启动荧光PCR体系。

    您可以从实验角度得到多种选择，得到高产量、特异和灵活的定量PCR试剂体系！

    高产量和特异性的扩增

    FQ PCR  MASTER Mix-UDG（hot start）提供了强大的PCR扩增，可以使用多个模板组。所使用的Taq DNA聚合酶具有热启动特性。这极大地降低和消除了错误配对和非特异性扩增，使您得到较高产量，并增加特异性。整合的UDG（尿苷酸DNA糖基化酶）防止残余污染的能力防止了非模板DNA的扩增，从而降低了假阳性，使结果更可靠。

    在产量和灵敏度方面，Quantitative PCR  MASTER Mix-UDG（hot start）的灵敏度极高（阈循环）。您可以更精确地定量低拷贝的基因，并在较宽的目的浓度范围内检测线性剂量反应。

    高度灵活性

    除了灵敏度和特异性外，Universal PCR Master Mix Kit在分析设置，检测方法和设备上给您提供了较高的自由度。使用Universal PCR Master Mix Kit，您可以：

    对扩增的不同模板优化镁离子浓度，由于提供了附加的氯化镁，所以您可以方便地配置Mix体系。

    可以更灵活的进行普通PCR和荧光PCR。

    可以在多种设备上使用，如ABI Prism® 7700, ABI GeneAmp® 5700和Bio-Rad的I-Cycler。

    可以利用多种检测方法的优点，包括TaqMan®探针和Molecular Beacon，您不必局限于特定的试剂盒。

    您还可以灵活的选择进行自配荧光PCR体系，不论是含UNG/dUTP防污染系统还是不含该系统的。

    2、 反应体系配制：

    A2010A0101 试剂盒：（探针体系）

    FQ-PCR MasterMix-UNG混合物(2X) 25ul（终浓度为1×）；

    上游引物（终浓度为50——900nM）（可先设200 nM），下游引物（终浓度为50——900nM）（可先设200 nM）；探针（终浓度为200nM）；待检样品 5ul（终浓度为10——100ng）；

    无菌去离子水 补足，使总体积达到 50ul 。

    您可以选择荧光染料SYBGREEN体系，具体请参照说明书。

    您可灵活使用20-50ul间其他体积，注意保证终浓度相同。

    A2010A0106 试剂盒:

    反应体系终浓度(自配热启动荧光系统)：

    1-2U的hot start Taq酶、3-5.5mM的Mg2+、0.2mM的dNTPs、 1×PCR buffer（A2010A0106）；50——900nM 的上游引物（可先设200 nM）、50——900nM 的下游引物（可先设200 nM）、200nM的探针、通常取2-5ul的模板, 无菌去离子水 补足，反应总体积通常为20——50ul

    自配热启动荧光——UNG 体系：

    1-2U的Taq酶、1×PCR buffer、2.5-4.0mM的Mg2+（A2010A0105 ）；0.2-1U的UNG酶(A2010A0107)（可先设为0.5U）、0.2mM的d(A,C,G)TPs、0.2-0.4mMdUTP（要调整）(A2010A0108)；50——900nM 的上游引物（可先设200 nM）、50——900nM 的下游引物（可先设200 nM）、200nM的探针、通常取2-5ul的模板、反应总体积通常为20——50ul

    3、 反应体系和条件的优化:

    使用高产量，特异和灵活的定量PCR试剂体系FQ PCR  MASTER Mix-UDG（hot start），优化参数最少。您只需要优化退火温度，就可以得到更灵敏、更可靠的定量结果。对于特殊结构的荧光PCR，您可以优化引物浓度，来得到更特异或更灵敏的结果。

• 使用通用PCR Master Mix 试剂盒进行反应体系的配制，可以适合更多的反应体系，如mRNA的普通RT-PCR检测，适用于合成质粒的PCR，同时也适用于荧光PCR，范围更宽。
• 采用成套的hot start Taq酶 kit(A2010A0106)，该试剂盒中含有进行热启动荧光核心试剂盒的所有成分，也降低了选择纯度不够或不合适产品的风险。您需要根据以下原则进行优化：
• 您需要对酶量和镁离子浓度进行优化。酶的推荐反应浓度为1.25——1.5 U（50ul），必要时可在1-2U之间探讨酶的最佳条件；Mg离子推荐浓度普通PCR终浓度为1——3 mM, 荧光PCR终浓度为3——5.5 mM，请在该范围内探讨最佳条件。
• 试剂盒中提供的dNTP已经预混，能够充分保证产品质量和PCR的忠实性。dNTP选择经典的0.2mM的浓度即可。
• 另外，上游引物和下游引物浓度可先设为200 nM。当结果不理想时，可以在50nM——900nM之间进行探讨。
• 如选用Taqman探针，探针浓度可设为200 nM，不须探讨。选择其他种类的探针需根据要求设置探针浓度。
• 可以先用推荐的反应条件，如果结果不佳，可根据引物、探针设计的具体情况适合的退火温度，退火时间和循环数。
• DNA模板的添加量通常在100 ng以下，因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。如果欲进行2 Step RT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步的RT反应液作为DNA模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。
• 稀释所有探针、引物或配制模板请使用无菌双蒸水或Tris溶液。所有反应容器应保证无菌无酶无热源。如进行RNA反应应采用无RNA降解酶的水和容器进行操作。

    如采用hot start Taq酶来配制与A2010A0101相同的热启动荧光体系（含UNG/dUTP防污染体系），您可以选择A2010A0105，A2010A0107和A2010A0108进行。与A2010A0106不同的是除了以上的优化步骤外，还增加了对UNG/dUTP系统进行探讨。建议先使用A2010A0106优化好产品体系后，再来优化该防污染系统。

    0.2-1U的UNG酶(A2010A0107)（可先设为0.5U）、0.2mM的d(A,C,G)TPs、0.2-0.4mMdUTP (A2010A0108)。反应条件如酶量、Mg离子等都已经调好（参照A2010A0106）,您可以固定d(A,C,G)TPs的浓度为0.2mM，并设定UNG浓度为0.5U(50ul)，dUTP浓度也设为0.2mM，初步来看反应结果。如结果不理想可调整dUTP浓度（上调）。直至得到满意结果。并可进行防污染能力测试（用含U的扩增片断进行）。

    请参照3：影响PCR及荧光PCR 的其他因素进行优化。总之，优化的指标越多，实验的不确定性就越大。避免在操作中引入更大的不确定性和不可重复性。可参照的QPCR  MASTER Mix-UDG（hot start）使用注意事项。

    4、 适用的荧光仪器、实验设计、荧光曲线和数据分析；

    目前市场上有许多种实时PCR仪：其中包括ABI7700，ABI7900，ABI7000 (Applied Biosystems)；MX4000 (Stratagene)；iCycler (Bio-Rad)；Smartcycler(Cepheid)；Robocycler (MJ Research)；Lightcycler (Roche)；ROTORGENE(CORBERT) ；杭州博日（Linegene）。

    不同的仪器使用方法有所区别，但都具备对Taqman 探针和sybgreen 染料法的检测波长和检测能力。QPCR  MASTER Mix-UDG（hot start）和通用PCR Master Mix均适合在这些仪器上进行使用。

    为确保实验数据的有效性，每次实验都设阴性对照和4个标准品，每个样品都平行做2个复孔。

    基线或阀值的设定 通常是以10——15个循环的荧光值作为阀值，也可以以阴性对照荧光值的最高点作为基线。