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技术原理

影响PCR及荧光PCR的因素:引物

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2021-11-03

   引物的设计和选择符合荧光PCR的探针并进行设计对于实时荧光PCR尤其重要。可以说,不合理的设计意味着绝对的失败。但是,好的设计并不等于好的实验结果,影响PCR和荧光PCR的因素非常多,下面择其重要进行介绍。

    1.引物退火温度

    引物的一个重要参数是熔解温度(Tm)。这是当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下,退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火,同时还要足够高,以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。

    设定Tm有几种公式。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。大部分计算机程序使用近邻分析法——从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。所有oligo软件会自动计算引物的Tm值。在设置退火温度时可以如下进行:以低于估算的Tm5℃作为起始的退火温度,以2℃为增量,逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得最佳结果,两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5℃,就会由于在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同,将退火温度设定为比最低的Tm低5℃。或者为了提高特异性,可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环,然后再根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严谨的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。

    2.引物浓度

    引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5μM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。为了确定引物浓度,可以在260nm(OD260)测量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系数的倒数(nmol/OD),通过Beers法则(公式1)计算引物浓度。微摩消光系数可以使用公式2计算。与大分子双链DNA可以使用平均消光系数不同,确定引物的精确浓度必须使用计算的消光系数。这是因为引物较短,碱基组成差异很大。在oligo软件上可以计算出引物的的消光系数(OD/μmol)和消光系数的倒数(μmol/OD)。

    一般商业合成的引物以O.D.值表示量的多少,在一般情况下,20个碱基长的引物,1个O.D.加100ul水后引物浓度为50pmol/ul(50μM)。也可以用OLIGO软件,根据引物的的消光系数(OD/μmol),计算出一定的工作浓度下,引物的加水量。

    浓度(μM)=A260(OD/ml)×稀释系数×消光系数的倒数(nmol/OD)

    举例:计算某寡核苷酸(溶于1ml水中),取其中的10μl稀释100倍(加入990μl)水中。在A260处测吸光度为0.2。计算消光系数的倒数为4.8 nmol/OD,代入得:

    浓度=0.2(OD/ml)×100×4.8(nmol/OD)=96nmol/ml=96μM

    3.引物、探针的纯度和稳定性

    定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的。部分应用需要纯化,以除去在合成过程中的任何非全长序列。这些截断序列的产生是因为DNA合成化学的效率不是100%。这是个循环过程,在每个碱基加入时使用重复化学反应,使DNA从3'到5'合成。在任何一个循环都可能失败。较长的引物,尤其是大于50个碱基,截断序列的比例很大,可能需要纯化。

    引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。定制引物以干粉形式运输。最好在TE重溶引物,使其最终浓度为100μM。也可以用双蒸水溶解。

    引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。以大于10μM浓度溶于TE的引物在-20℃可以稳定保存6个月,但在室温(15℃到30℃)仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年,在室温(15℃到30℃)最多可以保存2个月。

    探针即寡核苷酸进行荧光基团的标记,标记本身有效率的区别。探针标记以后一般应该纯化,纯度高、标记效率高的探针不仅荧光值高,且保存时间可以高达一年以上。不同的生物技术公司探针标记效率和纯度有很大的区别。

    由于反复冻融易导致探针降解,在确认探针质量好的情况下,最好稀释成2uM(10×),作为工作浓度分装多支,避光保存。

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