PCR技术在致病菌检测中的应用有哪些

作者：张永祥 辛锡龙   发布时间：2020-08-14

    摘要：聚合酶链反应 (PCR) 技术以其具有的特异性强 , 灵敏度高 , 快速准确 , 自动化高的特点 , 被广泛的应用于医学、生命科学、农业科学、环境科学、考古学等领域。PCR 技术的发展为食品病原微生物的鉴定提供了新的途径 ; 对传染性病原菌的诊断提供了快速、灵敏的检测手段。为此 , 对国内应用 PCR 技术检测致病菌的研究成果作一综述 , 供同行借鉴。

    关键词 　聚合酶链反应 ; 致病菌 ; 检测

    聚合酶链反应 (Polymerase Chain Reaction ,PCR) 是 1985 年诞生的一项体外扩增 DNA 的方法 ,具有特异性强、灵敏度高、快速准确、自动化程度高等特点 , 自问世以来 , 已在医学、生命科学、农业科学、环境科学、考古学等许多领域得到了广泛的应用 , 并结合其它技术衍出了许多优良技术 , 如反转录 PCR ( Reverse Transcription - PCR) 、多 PCR (Multiple Primer PCR) 、不对称 PCR (Asymmet2ric PCR) 、错配 PCR (Mismatched PCR) 、原位 PCR( In Situ PCR) 、PCR - RFLP ( Restriction FragmentLength Polymorphism) 、PCR - SSCP ( Single StrandConformational Polymorphism) 、PCR - ASO ( AllelaSpecific Oligonucleitides) 、RAPD - PCR (Random Am2plifiedPolymorphic DNA - PCR) 、DDRT - PCR (Dif2ferential Display RT - PCR) 、定量 PCR、免疫 PCR等。本文对 PCR 技术在致病菌检测和转基因检测中的应用作一介绍。

    1 PCR 技术的原理

    PCR技术原理是在体外合适条件下 , 以单链 DNA 为模板 , 以 1 对人工合成的寡核苷酸为引物 , 在热稳定DNA 聚合酶作用下特异性扩增 DNA 片段的技术。整个反应过程通常由 20——40 个 PCR 循环组成 , 每 个 PCR 循环包括高温变性 - 低温复性 - 适温延伸 3个步骤。方法是首先将靶 DNA 双链加热变性为单链 , 然后加入 2 段人工合成的与靶 DNA 2 端邻近序列互补的寡核苷酸片段作为引物 , 即左端引物和右端引物 ; 该对引物与互补的 DNA 单链碱基互补结合后 , 在有 DNA 多聚酶和 4 种 dNTPs 底物存在的情况下 , 引物沿模板 DNA 链 (靶 DNA 单链) 按 5’末端向 3’末端方向延伸 , 自动合成新的 DNA双链 , 新合成的 DNA 双链又可作为扩增的模板 ,继续重复以上的 DNA 聚合酶反应。经过 25——35 次循环 , 可将靶 DNA 序列扩增近百万倍。

    2 PCR 技术在食品致病菌检测中的应用

    传统方法检测食品中致病菌的步骤繁琐费时 ,需经富集培养、分离培养、形态特征观察、生理生化反应、血清学鉴定以及必要的动物试验等过程 ,并且传统方法无法对那些难以人工培养的微生物进行检测。而应用 PCR 技术 , 只需数小时 , 就可以电泳法检测出 011mgDNA 中仅含数个拷贝的模板序列 ; 用 PCR 扩增细菌中保守的 rDNA 片段 , 还可对那些人工无法培养的微生物进行检测。利用 PCR 检测食品中的致病菌 , 首先要富集细菌细胞 , 通常经离心沉淀、滤膜过滤等方法可从样品中获得细菌细胞 , 然后裂解细胞 , 使细胞中的DNA 释放 , 纯化后经 PCR 扩增细胞靶 DNA 的特异性序列 , 最后用电泳法或特异性核酸探针检测扩增的 DNA 序列。

    2. 1 　检测单核细胞增生李斯特菌 　单核细胞增生

    李斯特菌 (Listeria monocytogenes) 是食品卫生中的重要病原菌 , 多通过食品经口感染 , 被列为 20 世 纪 90 年代食品中的 4 大病原菌之一。有关单核细胞增生李斯特菌污染乳制品、肉、禽、蔬菜的研究国内外均有报道。该菌可诱发食物中毒 , 导致李斯特菌病 , 主要引起人类脑膜炎、菌血症等 , 发病率虽低 , 死亡率却高达 30 %——70 %。传统方法从食· 611 · 中国国境卫生检疫杂志 2003 年 4 月第 26 卷第 2 期 Chin J Frontier Health Quarantine Apr. 2003 , Vol 26 , No. 2品中分离、鉴定该菌约需 1——2 周才能得出结果 ,免疫学方法和基因探针已用于该菌的快速检测 , 但前者可达到属水平的特异性 , 后者敏感性差。国外已广泛将 PCR 技术用于快速鉴定单核细

    胞增生李斯特菌1 ——3 , 国内的报道也不少。杨百亮等 (1994) 通过条件优化 , 建立了快速检测牛奶中单核细胞增生李斯特菌的试剂盒4 , 并在同年报道了以 1 对位于该菌β- 溶血素基因内的 26bp 寡核苷酸为引物 , 用 PCR 对市售猪肉和牛奶中的单核细胞增生李斯特菌的检测5 。李氏溶血素 O 基因与内化素基因是单核细胞增生李斯特菌最主要的致病因子与侵袭因子 , 这 2个致病基因的位点均在染色体上。溶血素由 hlyA基因编码 , 且 hlyA 基因在该菌中保守。姜永强等(1998) 根据发表的单核细胞增生性李斯特菌的重要毒力基因 hlyA 的全基因序列 , 设计引物 , 建立了该菌的 PCR 诊断方法 , 结果显示扩增可获得预期 743bp 的片段 , 且扩增具有极好的种特异性。同时 , 实验结果表明 , 用食品标本检测时 , 许多复杂成分含抑制 Tag 酶的活性 , 当经过增菌培养 , 并对培养物进行化学抽提 , 去除样品中的脂类和蛋白质 , 纯化的菌体经加热裂解后直接用作 PCR 反应模板 , 可大大提高检出率6 。陈倩等 (1998) 应用

    2 对引物 ( HIY1 - 2及 Inl1 - 2) 对 50 件速冻食品经 2次增菌后固相吸附法提取 DNA , 分别用 PCR 检测单增李斯特菌的溶血素 O 基因及侵袭因子内化素基因 , 结果表明 , PCR 法快速准确检测标本阳性率为 12 %7 。陈伟伟等 (2000) 用 PCR 法对福建省内的 6 类食品 (生肉、熟肉制品、乳、蔬菜、水产品及冷饮) 总共 265 份样品进行了李斯特菌 2 种致病因子的检测 , 结果表明总阳性率为6. 42 % ,污染程度最严重的是生肉 (23. 33 %) ,其次为水产品(3. 33 %) 8 。实验证明先将标本增菌接种平板培养 , 然后提取 DNA 作 PCR 测定 , 从每 ml 牛乳或每 g 牛排中检获 0. 1cfu 的单增李斯特氏菌9 。

    2. 2 检测金黄色葡萄球菌 

　金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 是各种类型感染和食物中毒的病原菌 , 能在食物内增殖并产生体外毒素 - 肠毒素 (SE) 、内毒素 - 中毒休克综合征毒素 (TssT1)和脱皮毒素 (ETA、ETB) 。金黄色葡萄球菌肠毒素是 1 种可溶性耐高热蛋白 , 根据血清型别不同 , 分为 A、B、C、D 和 E5个型。所有的金黄色葡萄球菌肠毒素都有一个相同的基本结构即含有二硫键和单一多肽链。其中肠毒素 D (SED) 的基因位于质粒上 , 由 256 个氨基酸残基组成 , 基因长为 774 个碱基对 , 已全部定位。目前金黄色葡萄球菌肠毒素 D 的鉴定主要是依赖于免疫学技术 , 该技术需要细菌纯培养和制备肠毒素 , 实验周期长、步骤繁多 , 使其在食品卫生学鉴定时受到限制 , 近年来 PCR 技术的发展为食品病原微 生 物 的 鉴 定 提 供 了 新 的 途 径。云 泓 若 等(1999) 选择 SED 基因的第 360——381 碱基为上游引物 , 第 654——675 碱基为下游引物 , 应用 PCR 技术扩增出 SED 基因的 316bp 长的 DNA 片段 , 并建立了直接利用细菌裂解液作为模板的 PCR 方法10 。

    2. 3 检测沙门菌

    沙门菌是一种人畜共患的传染

    性病原菌 , 近年来 , 对沙门菌快速诊断的方法已有了很大进展 , 如应用 ELISA 法、EIA 技术 , 间接血凝抑制试验、HRP - SPA 染色法和 PCR 技术等。毫无疑问 PCR 技术由于具备高度特异灵敏和快速的特点 , 已引起越来越广泛的重视。FadI 等 (1995)应用 PCR 技术检测沙门菌 , 特异性达 100 %11 。沈孝民 (1997) 用 PCR 技术对各种不同血清型的沙门菌和已知被该菌污染的鱼粉和动物产品的肉汤培养物进行了检测 , 结果显示该方法特异性高 , 且灵敏、快速 , 可检出 0105pg 水平的 DNA , 并可在1d 之内完成12 。

    2. 4 　检测致病性大肠杆菌
　肠毒素大肠杆菌(ETEC) 是引起婴幼儿和幼畜腹泻的主要病因之一 , 该菌可产生 2 种肠毒素 : 热敏性肠毒素 LT 和耐热性肠毒素 ST , 它们均能引起肠粘膜细胞水与电解质的代解紊乱并导致腹泻。ETEC 引起的腹泻主要是食入了被该菌污染的食品所致。PCR 技术为临床和实验室提供了一个更为快速灵敏的检测手段。王嘉福等(1997) 根据 LT和 ST基因序列 , 合成了引物 , 并对 128 份食品样品中 ETEC 肠毒素基因 (LT和 ST) 片段进行扩增 , 结果共有 15 个样品被检出污染了 ETEC , 并且证实用于扩增的引物具有高度特异性13 。卢林耿等 (1999) 用 PCR 法检测大肠杆菌 O157 的志贺样毒素基因 , 实验表明引物具有高特异性14 。

    2. 5 　其它致病细菌的检测

    目前已建立了应用PCR 方法检测多种致病菌的方法 , 如大肠杆菌、类大肠杆菌、军团菌属、志贺菌、沙门菌等 , 但除了水样外 , 其它样品的细菌 PCR 检测方法未见报道。一般用PCR 扩增β- 半乳糖苷酶 (lacZ) 基因检测中国国境卫生检疫杂志 2003 年 4 月第 26 卷第 2 期 　Chin J Frontier Health Quarantine Apr. 2003 , Vol 26 , No. 2 · 711 ·水样中大肠杆菌类 , 用扩增的β- 葡萄糖醛苷酶(Mid) 基因检测 1 种大肠杆菌和志贺菌属15 。段广才等 (1994) 根据霍乱弧菌肠毒素基因 ctxA 和大肠杆菌肠毒素基因 eltA 序列设计了 1 对引物 , 建立了从水样中检测 ctxA 的 PCR 快速鉴定方法16 。

    3 　应用 PCR 技术检测转基因产品

    自 1983 年第一株转基因植物诞生以来 , 转基因作物源源不断地走出实验室进入大田并商品化 ,并作为食品原料进入食品市场。目前 , 转基因的检测方法主要是 PCR 和 ELISA。ELISA 法检测转入基因的蛋白表达 , 灵敏度较低 , 而 PCR 法适合于各类样品包括原料和经过加工的食品。但是 , 尽管能通过 PCR 等检测技术来鉴别是否为转基因产品 ,但该食品若经深加工后结构有了很大的变化 , 就很难定性、定量地确定 , 而且转基因食品的安全性还不能单凭上述检测结果来判定17 。曹际娟等 (2001) 应用荧光定量PCR仪对转基因玉米及其粗加工食品如爆玉米花、熟玉米棒、速溶玉米片中通常通入的基因构建元件 35S 启动子、NOS终止子和外源抗虫 CryI A (b) 目的基因进行了检测 , 对转基因玉米的检测低限可达到 0. 1 %18 。陈家华等 (2001) 应用 PCR 技术 , 建立了检测转基因抗草甘膦油菜籽中草甘膦氧化还原酶基因的技术和方法19 。覃文等 (2001) 运用 PCR 技术 , 以 Gene Scan法代替琼脂糖凝胶电泳 , 建立了一套准确、快速的检测转基因产品的方法 , 检测了转基因大豆的 35S启动子、NOS 终止子和抗除草剂 (草甘膦) 3 种转基因成分 , 检测了转基因玉米的 35S 启动子和抗虫(Cry) 2 种转基因成分 , 结果显示 , 该法灵敏度高 ,重现性好 , 假阳性少 , 是分析检测转基因产品的一种实用方法20 。

    总之 , 由于 PCR 技术可以快速特异地扩增任何期望的 DNA 片断和目的基因 , 因而在食品检验领域有重要的实际应用价值。但在实际应用中也存在一些问题 , 如极少量外源性 DNA 引起的污染可能导致假阳性出现 ; 实验条件不当导物产生突变 ;引物设计及靶序列选择不当可能降低灵敏度和特异性等21 。尽管还存在着一定的问题 , 相信随着该技术的进一步普及、发展和完善 , PCR技术将会得到更加普遍的应用和发挥更大的作用。

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