孙雷：我对新冠病毒测序工作的思考

作者：荧光定量PCR仪   发布时间：2020-05-29

    在此次新冠病毒疫情的发现和防控当中，包括基因测序、RT-PCR在内的病原检测技术做出了有目共睹的贡献，也接受了前所未有的压力和挑战。这篇文章总结了病原核酸检测在此次疫情中发挥的作用，以及个人对病原测序行业未来的一些思考。

    新冠病毒的发现

    

    （图片来源：网络）

    毋庸置疑，基因测序技术在此次新冠病毒的发现中起了非常关键的作用。

    首先，复旦大学张永振团队从一位病人的肺泡灌洗液样本中提取病毒，通过二代测序准确地测定了病毒的基因序列，上传到GenBank，并指出了它和SARS病毒的相似度（Wu et al, “A new coronavirus associated with human respiratory disease in China”）。

    接着，中科院武汉病毒所石正丽团队通过对5个病人样本的测序判定病毒和来自蝙蝠的BatCoV RaTG13病毒序列更为相近，但和SARS病毒有同样的ACE2 cell entry receptor。同一团队设计出了正确的qPCR原理检测方法（Zhou et al, “Discovery of a novel coronavirus associated with the recent pneumonia outbreak in humans and its potential bat origin”）。这为迅速判定疫情和对病人确诊打下了基础。

    此后，中国疾控中心谭文杰团队使用三种测序方法（Lu et al, “Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding”)分析了病毒的变异位点和进化树。

    至此，我国科研单位在差不多一个月之内迅速发现了正确的致病病毒并完成测序，和全世界分享了病毒的序列和已知变异，给出了有效的核酸扩增荧光定量检测方法。这些工作都得到了各国政府和世界卫生组织WHO的高度评价。

    在这些发现新冠病毒的工作中发挥出色的是mNGS（metagenomics next generation sequencing，宏基因组测序）技术。发现新病原的关键在于高通量和准确率。因为新病原在样本中的丰度和序列未知，因此为从大量的背景核酸中判定新病毒数据，必须要有足够的reads数来支持生信分析。

    从复旦张永振团队的文章可以看出，为了拿到未知病毒120K准确的Reads，整个metagenomics测序通量达到了50M以上(多余DNA序列来自人和其它微生物)。

    从文中还可以看到病毒测序的覆盖率很不均匀，这个现象可能和逆转录或扩增的偏好有关，会提升了数据量要求和序列组装的难度。高准确率的重要性对de novo测序毋需多言。在没有准确reference提供比对依据的时候，原始数据的准确率对组装至关重要。二代测序优秀的通量和准确率在此得到充分的体现。

    对于三代测序（单分子测序）而言，其优势在于通过减少扩增来达到更均匀的基因组覆盖和更真实的病原丰度排序。病人样品里的病毒RNA丰度非常有限，而且RNA在样本储存，提取和逆转录过程中会进一步损失。

    因此现在所有的mNGS测序方法都必须经过两次扩增：第一步是cDNA文库PCR， 第二步是测序前的RPA/RCA扩增或桥式PCR。病原单分子测序工作只需要文库制备后的扩增，对cDNA的扩增也必须优化以尽量减少偏好性。

    国内的科研机构和科技企业已经在积极开发针对新冠病毒测序的三代测序方案，其中包括中国疾控中心的Nanopore测序方案，真迈生物基于GenoCare测序仪的单分子测序试剂盒，以及贝瑞基因基于PacBio Sequel-II测序仪的单分子测序试剂盒。

    值得一提的是，单分子直接RNA测序在未来是一个很有潜力的病原测序途径。现在它的准确率和读长仍和cDNA测序有一定距离，但是这一方法可以直接测量病毒RNA碱基的修饰（Viehweger et al, “Direct RNA nanopore sequencing of full-length coronavirus genomes provides novel insights into structural variants and enables modification analysis”）。我们期待在这个方向上有更多的成果来阐明RNA修饰在病毒中的作用。

    新冠病毒的核酸检测

    

    新冠病毒的主流核酸检测方法无疑是荧光定量PCR，但这里我不赘述PCR的技术细节。最近大家意见比较多的一个问题就是荧光PCR的假阴性率高，然后是操作时间过长，最后是对于不同样品的敏感度。

    这几个问题跟癌症早筛面临的问题相似。假阴性和操作时间其实是互相矛盾的。速度越快，扩增效率越低，阳性率会越差。平心而论，荧光PCR的使用还是非常成功的。

    核酸检测的假阴性问题虽然要尽量解决，但分子诊断中由于检测限和样品质量问题出现假阴很难避免。导致检测错误出现的因素是多方面的，网络上已有专业人士对此进行充分的技术普及，这里我只想说一下病人样品种类这一点。

    最近深圳市第三人民医院的研究显示，痰液样品的阳性率大大超过咽拭子这样的固体样品（Yang et al, ”Evaluating the accuracy of different respiratory specimens in the laboratory diagnosis and monitoring the viral shedding of 2019-nCoV infection”）。 在核酸检测方法上，进一步优化样品采集方式可能是最值得做的工作。

    其它检测方法中，等温扩增和免疫检测虽然更快，但特异性和检测限相比于荧光PCR没有优势；CT检查则难以做到规模化的广泛使用。

    这次疫情对中国的体外诊断行业是一个巨大的考验。为了帮助医院尽快诊断，做好诊断，上百家企业在春节期间加班加点赶制检测试剂盒和仪器。这种“饱和式救援“保证了节后的试剂盒供应充足，也把整个产业链推到了极限。

    我们应当对中国IVD行业整体的快速响应和努力付出感到自豪，同时也期待在以下方面能有更大的提升：

    核心原料的产能和质量还要进一步提高。大部分的IVD公司都只有设计试剂盒的能力，而没有提供试剂原料的能力。这些原料的产量和质量对检测试剂盒的性能是至关重要的，国内的原料供应链企业在此次疫情中也暴露出了极限生产时的速度和供货困难。

    如果一些IVD企业在拥有检测方法的同时也具备核心原料的自主制备能力或产业链布局，可以期待它们能够更从容地应对突发疫情，在赶进度的同时保障试剂的供应和质量。

    快速检测的技术储备需要加强。快速检测虽然不一定最准确，但是它对于基层医疗机构确实是有价值的。

    现在这些快速检测产品的供应商大部分都还是比较年轻的公司，在当前的竞争中相比于PCR企业处于劣势。但是几年之后，他们可能就会像行业的前辈们一样积攒足够的商誉，像等温扩增试剂检测盒这样的产品会得到更多的应用。

    现在几种主流的核酸快检方法，如RPA、SHERLOCK和LOOP，都是试剂比较复杂的体系。国内的厂商大多需要自己做试剂和仪器，而不是像PCR行业一样有比较可靠的产业链提供试剂，有通用的实时荧光定量PCR仪可以借助。

    可以预见，下一步核酸快检会得到更多的支持，类似于PCR的产业链和通用仪器会形成，下一次传染病危机中快检产品的开发速度和质量都会提高。

    新冠之后的病原测序

    如上所述，测序对于病毒的发现和研究（包括分类，溯源，蛋白研究，疫苗开发）非常重要，但是在诊断中就没有大量用到测序。第一，毕竟测序太贵；第二，测序需要的样本量高；第三，测序需要的时间相对更长。

    那么，这次疫情之后测序仪在医院的应用会不会加速？答案是：可以预期。具备测序仪制造能力的企业都会推动其产品在病原测序方向的报证，测序仪在医院的投放会增加。但也可以预计，只有科研能力强的医院会真正做病原变异和微生物宏基因组方面的工作。

    大部分三甲医院主要还是用更加简便和快速的核酸检测方法测已知病原，它们可能会更多的把力量花在qPCR能力、快速检测设备以及生物安全防护能力的提升上。而对于未知病原的测序，将更多的还是由CDC和中科院病毒所这样的机构去实施。

    那么第三方检测机构会不会购买更多的测序仪呢? 很有可能。以后可能会形成医院做常见病原的PCR检测、第三方检验机构做疑难感染病原测序的分工。第三方检验机构的测序一定要能够给出一个广谱的病原鉴定结果。

    所以相应病原测序产品的通量要高，病原数据库要大。至于它是否有医疗器械证反而不一定很重要。广谱病原检测的医疗器械证用什么标准审批也是一个问题。国家药监局需要制定新的规范和标准盘。

    此次疫情以后，国家必定会采取一些措施防止疫情重现，提升抗疫能力。其中和测序相关的一些可能的举措有：

    长期监测传染病高发地点的病原分布，提前预警：这包括海鲜市场，肉类批发市场，人群聚集场所这些地点。疾控部门的检测会突破现有的已知病原范畴，进入未知病原的预警和疫苗目标的预判工作。样品可能会交由第三方检验机构进行测序。

    追踪病毒变异：历史上强传染性病原变异重现非常普遍。如2009H1N1流感病毒在美国爆发，变异后扩展到全球，一直到现在还会传播 （Ref：https://www.cdc.gov/flu/pandemic-resources/2009-h1n1-pandemic.html）。

    哪怕是比较小的变异也可能会对病毒的传染性造成很大影响（Maurer-Stroh et al, “A new common mutation in the hemagglutinin of the 2009 (H1N1) influenza A virus”），因此疾控部门的病原测序会成为长期的工作。

    加强储备针对冠状病毒的药物和疫苗技术：冠状病毒已经给中国带来了SARS和COVID-19两次大规模的疫情，这表明我国人群对冠状病毒可能有一定的易感性。

    因此，即使是在此次新冠疫情结束之后，也需要持续开展针对冠状病毒的药物开发，尤其要对一些现有药物做进一步的测试和评估，把它们推过安全性验证阶段，可能成为未来抗疫立刻可用的武器。

    在预防方面，针对冠状病毒的广谱疫苗的开发势在必行，开发中必须绕开高频变异位点，兼顾相似病毒。

    监测医院病原环境，控制院内交叉感染：高达40%的院内传染率（Wang et al, “Clinical Characteristics of 138 Hospitalized Patients With 2019 Novel Coronavirus–Infected Pneumonia in Wuhan, China”）是造成这次疫情扩大的一大原因。

    历史上病毒/细菌交叉感染也是重症的一大来源，对医院、社区诊所的定时病原监测很有意义。

    不过这不会是一件容易的事。可以想象，由于医院气溶胶环境的复杂性，测序检出的结果将是一个很长的微生物清单，如何从中得到有效的解读将是一个不小的挑战。但我仍然认为值得去做。

    我们现在所熟悉的PM2.5指数也不是从来就有，但关注的人多了就会天天测，而且成为污染治理的一个标准。微生物测序也可以提供一个类似的引导。此外，如果能开发出一种能够直接从空气中取气溶胶病原样品测序的仪器，将会非常有价值。

    以上仅是我对病原测序行业未来发展的一些个人思考。作为一名在基因行业里超过20年的从业者，我想说的是，虽然此次新冠抗疫之战使得基因检测技术成为大众瞩目的焦点，但最好的技术并不是用来赢得战“疫”，而是用来防止战“疫”的出现。这才是我们投身于基因科技的初衷。