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新型冠状病毒核酸检测方法有哪些

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2020-05-28

    临床上最常用的病原体快速检测技术主要包括两大类,即核酸检测和抗原抗体检测(我们在前期的文章中进行过梳理)。核酸(DNA或RNA)作为病毒的遗传物质,任何物种都有独一无二的核酸序列,对样本中核酸特征序列进行检测便可确定病原体。目前,核酸检测方法主要包括PCR法、恒温扩增法、测序法、CRISPR检测法等。

    数字PCR法

    数字PCR技术是第三代PCR技术,是一种核酸分子绝对定量的检测方法。现阶段,核酸分子的定量有三种方法:光度法基于核酸分子的吸光度来定量;实时荧光定量PCR基于Ct值,即指可以检测到荧光值对应的循环数;数字PCR作为最新定量技术,主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法,借助专门设备将50微升左右核酸溶液样本大量稀释后,分割成了近10万个液滴分散至芯片的微反应器或微滴中,单一液滴为独立反应单元,每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。

    经过PCR循环扩增后,有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号,没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积,就可以推算出原始溶液的核酸浓度,从而实现样本核酸分子绝对定量,即直接计算出核酸数量。

    数字PCR法和荧光PCR法的关键区别在于检测结果的绝对定量和相对定量差异。据了解,现阶段数字PCR试剂和机器相价格加高(一台仪器近百万元),在SARS-CoV-2快速检测中的优势并不大。

    不过,由于具备自动化程度更好、耗时更短等技术优势,国内多家掌握了数字PCR技术的核酸试剂研发企业正在尝试开发适用于SARS-CoV-2检测的相关试剂盒。

    测序法

    测序法可直接解读出核酸碱基的排列顺序,对于一个完全未知的新病毒来说,测序是必须的。测序技术虽然早在1977年就已发明,并在“人类基因组计划”末期突破重要技术瓶颈开始迅猛发展,仍只有少数企业研制出新型冠状病毒核酸测序试剂盒并投入生产。

    CRISPR检测技术法

    基于CRISPR的检测技术是一种新的新冠病毒RNA检测,仅需纯化的核酸分子样本,通过简单三步即可在1个小时的时间里完成检测。张峰团队在SARS-Cov-2疫情进展后不久曾公开发表过一项基于该技术的核酸检测方法。

    他们的主要工具是Cas13a切割酶和针对靶序列设计的两条gRNA,一条针对S基因,一条针对Orf1ab基因。理论上,只要样本里有SARS-Cov-2病毒相应RNA,gRNA就会引导Cas13a去切割靶RNA,所以阳性组会出现两条片段,而阴性组则仅有一条对照条带。不过,张峰团队的这项成果还处于临床研究中。

    恒温扩增法

    恒温扩增技术避免了荧光PCR法中对样本实施的温度调整,主要涉及2类技术,一类是利用特殊酶取代了PCR中高温解链的步骤,比如LAMP技术中的链置换DNA聚合酶和RPA中的重组酶、单链结合蛋白和链置换酶;另一类技术则涉及DNA和RNA之间相互转换来扩增,比如NASBA和TMA用到的逆转录酶和RNA聚合酶。

    荧光PCR技术是新冠病毒检测方法的主流方法,也是目前官方认可的SARS-CoV-2测定方法。荧光PCR步骤是指在反应体系中加入了荧光物质,通过专门仪器实现实时荧光检测,并对模板进行定量计算。为了增加灵敏度和特异性,荧光PCR法出现了不少改进版本,包括Taqman探针法、双重或多重荧光PCR等。荧光PCR法2-3小时完成核酸检测。

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