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荧光定量 PCR 为什么使用外标定量,而不是内标定量?

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2020-05-25

    1、内标对实时荧光定量 PCR 的影响

    若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标,则 PCR 反应变为双重 PCR,双重 PCR 反应 中存在两种模板之间的干扰和竞争,尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时,这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的,所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因,传统定量方法虽然加入内标,但仍然只是一种半定量的方法。

    2、荧光定量 PCR 无需内标定量

    实时荧光定量 PCR 技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限,实现了每一轮循环 均检测一次荧光信号的强度,并记录在电脑软件之中,通过对每个样品 Ct 值的计算,根据 标准曲线获得定量结果。实时荧光定量 PCR 无需内标是建立在两个基础之上的:

    (1)Ct 值的高度重现性 PCR 循环在到达 Ct 值所在的循环数时,刚刚进入真正的指数扩增期(对数期),此时微小误差尚未放大,因此 Ct 值的重现性极好,即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增,得到的 Ct 值是恒定的。

    (2)Ct 值与起始模板的线性关系由于 Ct 值与起始模板的对数存在线性关系,可利用标准曲线对未知样品进行定量测定, 因此,实时荧光定量 PCR 是一种采用外标准曲线定量的方法。

    外标法定量和内标法定量的方法学比较,得出的结论是:内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的,而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方法。

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