荧光定量PCR技术在临床肺结核防治中的应用

作者：王式春 刘渠 徐亚   发布时间：2020-05-12

    目前结核病仍是全球性的重大公共卫生问题之一。全球现有肺结核病人2000多万，其中95%在发展中国家，我国是22个结核病高负担国家之一，活动性肺结核患者居世界第二位，每年因结核病死亡的人数达剑15万人，给国家和社会带来沉重负担，严重影响我国经济和社会的发展。

    结核分枝杆菌的实验室检测是结核病诊断和治疗转归确认的重要依据。提高实验室检测能力，促进早诊断、早治疗是有效控制结核病蔓延的必要措施。目前临床以集菌培养和染色镜检法为主要的实验室检测手段。大量研究表明，传统方法的检出率低、培养周期长，难以满足临床需要。荧光定量PCR是近年发展起来的一种重要的基因诊断技术，具有灵敏度高、特异性好、可定量、污染少、易于标准化等优点，得到了广泛的应用[4-5]。本研究建立了荧光定量PCR检测临床结核分枝杆菌的方法，并对荧光定量PCR在临床肺结核诊断和疗效评估中的应用进行了评价，现将结果报告如下。
    

    1. 材料与方法

    1．1 标本

    1．1．1 疑似病人  采集2009——2010年5月到深圳市龙岗区慢性病医院诊断与治疗患者的痰液标本168份，其中男性115份，女性53份，年龄15——60岁。

    1．1．2 确诊患者  选择临床确诊肺结核病人，有低热、乏力、食欲不振、咳嗽和少量咯血等典型肺结核表现，X线健康检查肺部有结核病灶，实验室检测结果为阳性。为确保样本采集的连贯性，在争取病人同意随访的同时，选择暂时在家休养的就近病人。跟踪随访采集深圳市龙岗区慢性病医院诊断与治疗患者漱口后痰液，选取3例活动性肺结核患者，采集病人服药前1天的晨痰，随访中1——7日内每天采集1次，后续间隔2——5天采集1次。

    1．2 仪器  Bact/Alert 3D全自动细菌快速培养和药敏检测系统、Heraeus低温冷冻离心机Megafuge 1．0R、Biospec-mini DNA/RNA/Protein analyzer(岛津)、7500荧光定量PCR扩增仪(Applied Biosystems)、凝胶成像系统(英国UVI tec)。

    1．3 抗酸染色法与集菌培养法  操作参考《结核病诊断细菌学检验规程》[6]进行。

    1．4 痰液DNA的提取  取0.5ml 痰标本加入2倍样本体积4%的NaOH，液化10min后15000r/min离心5min，去上清液；向沉淀中加入0.5ml 灭菌水，充分振荡混匀，15 000r/min离心2min，去上清液，重复洗涤3次；沉淀中加入50 ul DNA提取液(1%NP-40 +2%Triton X-100)，充分振荡混匀，100℃水浴10min；待冷却至室温，15 000r/min离心5min，取上清液备用。

    1．5 荧光定量PCR方法

    1．5．1 引物与探针设计  针对IS6110基因设计引物与探针，上游引物：5’-GTC GCC CGT CTA CTT AAT G-3’，下游引物：5’-GCG GAT TCT TCG GTC GTG-3’，产物长度为107bp。探针：5’FAM-CCG ACG GTG CGT AAG TGG GTG CGT CGG-DABCYL3’，由上海基康生物技术有限公司合成。

    1．5．2 反应条件  反应体系(40 ul )：4.0 ul 10 X buffer，7.0mmol/L Mg2+，200 umol/L dNTP，0.2 u mol／L上下游引物，0.2 p mol/L探针，4 ul DNA模扳，2.5U Taq DNA聚合酶。扩增条件：94℃3min，94℃20s，52℃20s，72℃20s，40次循环。试验设定阳性对照、弱阳性对照与空白对照(no template control，NTC)。按照荧光定量PCR分析软件设定基线(baseline)与阈值(threshold)，以标准品浓度的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制标准曲线。

    1．5．3 标准品制备 以结核分枝杆菌H37Ra为参考菌株，PCR扩增IS6110基因并克隆刮质粒载体。提取纯化重组DNA，10倍梯度稀释至107Copies/ml 作为强阳性标准品，103Copies/ml 作为弱阳性标准品。

    1．5．4 特异性  以结核分枝杆菌H37Ra为阳性标本，提取牛型分枝杆菌、偶发分枝杆菌、蟾分枝杆菌、草分枝杆菌、龟分枝杆菌、肺炎链球菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎奈瑟氏菌为模板检测引物与探针的特异性。

    1．5．5 灵敏度与标准曲线绘制  抽提标准品DNA，10倍系列准确定量稀释102——107Copies/ml 的DNA模板，分别取4ul进行荧光定量PCR扩增。

    1．5．6 结果判定  荧光定量PCR扩增曲线规则，呈对数增长，Ct值≤36即可判定为阳性；如扩增曲线不规则或Ct值>40，报告为阴性；如Ct值在36——40之间，且扩增曲线呈对数增长，样本重复测定，如Ct值仍在36——40之间报告为阴性。

    2. 结果

    2．1 荧光定景PCR法的特异性  结核分枝杆菌H37Ra出现特异扩增，凝胶电泳出现107 bp条带。对该PCR产物进行测序，序列分析显示为结核分枝杆菌核酸序列，其他非结核分枝杆菌扩增结果均为阴性。

    2．2 荧光定量PCR法的灵敏度与线性  以10倍梯度稀释配制原始拷贝数102——107Copies/ml的标准品系列，取4ul 进行分子信标荧光定量PCR，绘制标准曲线，其回归方程为Ct=-3.61344 logC0+45.78456，线性范围为4 X 102——107Copies/ml，r=0.99503，Ct值与DNA模板含量呈线性关系。经多次重复试验，最低可检测4 Copies/反应。

    2．3 肺结核的诊断  采集168份疑似结核病人痰标本，集菌培养法和涂片染色法阳性检出率分别为35.12%(59/168)、12.5%(21/168)，荧光定量PCR法阳性检出率64.29%(108/168)，显著高于抗酸染色法和培养法，漏检率低。对抗酸染色法和培养法阳性的样本，荧光定量PCR法的灵敏度分别为100%和95.4%。对于非结核病人来源的痰标本，荧光定量PCR方法检测结果为阴性，符合率为100%。

    2．4 随访检测  随访周期3个月，对5例活动性肺结核进行了动态检测。荧光定量PCR检测结果显示，随着临床治疗方案的进行，病人晨痰中结核分枝杆菌的数量呈持续下降的趋势(即Ct值增加)。图2为随访期间连续4次测定病人标本的结果，Ct值分别为26.60、27.58、28.25、29.14，呈连续增加。为保证检测结果的准确性，每份晨痰都进行平行测定。

    随访期间，3例病人转阴，2例仍为阳性。病例1为男性，23岁，发病时间约2个月，病程较短，病情较轻，治疗前X线检查未见异常，痰涂片检查：涂阳1+，服药后在1个月内迅速转阴，结核分枝杆菌从105copies/ml 减少剑不能检出。病例2、3、4、5治疗前X线检查均有不同程度的异常，病程较长，患病时问在半年以上。如病例2为男性，41岁，X线检查右上肺可见斑片状、条索状模糊影，密度不均，边缘不清．其中间见一空洞，无栗粒。痰涂片检查结果为涂阳3+，诊断为III 型涂阳肺结核患者。经过3个月的治疗，4例病人咳嗽、咳痰等临床症状均有减轻。病例2和3涂片与荧光定量PCR检测结果均转阴性，病例4、5仍为阳性。图3为随访各病例结核分枝杆菌Ct值随时间的变化曲线。

    3. 讨论

    荧光定量PCR是近年发展迅速的基因诊断技术。与传统检测方法比较，荧光定量PCR的阳性检出率有显著提高，本研究中荧光定量PCR与传统的培养法和涂片法的阳性检出率分别是64.29%、35.12%、12.5%，与文献报道一。而且荧光定量PCR法极大地缩短了检测的时间，有助于对病人确诊并及时采取治疗手段。目前临床所用实验室检测方法十分落后，已成为阻碍我国结核病防治工作顺利展开的重要原因，在基层建立和推广特异性强、灵敏度高的检测方法非常必要。

    在对5名确诊结核病人的随访中发现，经过3个月的治疗，3名病人痰液中不再有结核分枝杆菌检出。另2名病人由于感染时间较长，并有较大程度的器质性改变，经过治疗虽未很快转阴，但排出的结核分枝杆菌数量也有显著减少。在随访监测期问，荧光定量PCR检测结核分枝杆菌的Ct值随着治疗的持续进行呈不断增加的趋势(即细菌数量减少)，且病人的临床症状均有所缓解。为确保随访的持续有效，本次符合的病例较少，对结核病治疗效果评价的规律还有待更多研究。但是，本次研究采用荧光定量PCR方法监测结核分枝杆菌变化情况，观察抗结核药物的治疗进展，并将治疗信息反馈给临床督导医生的方式，为临床医生及时掌握病人的病情和开展后续督导治疗提供了动态的数据，在实践中起到了积极的作用，效果明显，有重要的临床意义。