实时荧光定量pcr仪,国产品牌性能优越,欢迎在线选购!
PCR仪 > 常见问题

常见问题

PCR应用:PCR产物表达中提高忠实性

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2021-11-13

    包括克隆和效率分析,PCR产物表达或定点突变在内的PCR应用都需要高忠实性的PCR。Taq DNA聚合酶被看做是低忠实性的聚合酶,因为其缺少3'到5'外切核酸酶(校正)活性。使用带有3'到5'外切核酸酶活性的热稳定聚合酶可以提高忠实性。但是这些聚合酶的产量比Taq DNA聚合酶低。Platinum Pfx DNA聚合酶明显比Taq DNA聚合酶忠实性高,而且带有Platinum产品产量和特异性高的优点(图1)。
    提高忠实性pvr

    图1. Platinum? Pfx Taq DNA聚合酶的高灵敏度和特异性

    使用人thrombospondin的1.1kb片段的探针对基因组DNA(泳道1到6分别为100,50,10,5,1和0ng)扩增35个循环。A组,使用1单位Platinum Pfx Taq DNA聚合酶,在室温配制反应液。B组,使用2.5单PfuTurbo? DNA聚合酶,在冰上配制反应液。C组,使用1单位Taq DNA聚合酶,在冰上配制反应液。

    酶混合物

    将Taq DNA聚合酶同带有3'到5'外切核酸酶活性第二种聚合酶混合在一起可以获得比单独Taq DNA聚合酶高的忠实性,并可以得到高产量及扩增长模板。Gibco BRL高保真酶混合物,Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity忠实性是单独Taq DNA聚合酶的6倍,并可以最高扩增到12kb。

    其他参数

    除了酶,高浓度的dNTP或镁离子会降低忠实性。将dNTP的浓度从200μM降低到25-50μM可以增加精确度。如果四种核苷的浓度不同,忠实性会受影响。进行较少的PCR循环也会有助于增加忠实性,因为增加循环数目和产物长度就会增加突变可能性。

联系我们

联系人:王先生

手机:19923442229

电话:+86-519-88812307

邮箱:19923442229

地址:江苏省常州市武进区科教城创研港