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常见问题

PCR扩增后出现非特异性条带的原因

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2021-11-09

    PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现,其原因:

    一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。

    二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增。

    其对策有:

    ①必要时重新设计引物。

    ②减低酶量或调换另一来源的酶。

    ③降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数。

    ④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性,65℃左右退火与延伸)。

    出现片状拖带或涂抹带

    PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起。

    其对策有:

    ①减少酶量,或调换另一来源的酶。

    ②减少dNTP的浓度。

    ③适当降低Mg2+浓度。

    ④增加模板量,减少循环次数。

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