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常见问题

pcr测序发现引物有突变是怎么回事?

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2021-11-01

    答:测序发现引物区域有突变,特别是40个碱基以下的引物, 发生的概率不大,但是肯定也会发生。用户一般可以放心,引物序列一般都是通过电脑直接将您的序列COPY到合成仪的,碱基输错的机会不多。我们有一套控制办法,预防碱基输入错误。发生这种突变的原因有很多解释,人们还没有办法彻底解决这个问题。引物合成的固相合成原理都一样,采用的机器也基本相同,合成主要原料都是由可数的几家跨国公司提供的,所有每个合成服务商遇到的问题也基本类似,没有人可以超脱。

    引物合成是一种多步骤的化学反应,合成效率最高也就是99%,副产品不可以避免。引物序列中插入突变往往是碱基重复,一般认为,偶连过程中,正在偶连的部分单体发生丢失DMT,导致单体又接了上去,故发生插入同一碱基的突变。至于缺失突变,一般认为是一般认为是带帽(capping)反应不彻底造成的,Caping反应主要是封闭极少数5'-羟基没有参加反应单体。被封闭的引物,在下一轮偶连时将不能继续参与合成。对于碱基置换的突变,产生的原因一般认为是碱基不能100%脱保护,即引物上可能含有残留保护基团,引物的这些区域不能很好地与互补链配对,当扩增的产品被亚克隆转化到大肠杆菌中,可能被细菌中修复系统补上了非配对的碱基。置换突变通常发生在G 转换成其它碱基。碱基G在一定条件下可以转化为烯醇异构体 (脱嘌呤),2,6 diaminopurine , DNA复制和扩增过程中DNA聚合酶将2,6 diaminopurine看作碱基A,测序就会发现碱基G-A置换。脱嘌呤现象在富含嘌呤的引物中发生的频率较高。脱嘌呤的引物在引物后处理脱保护阶段如果被降解,测序就会发现碱基G或A的缺失。

    引物合成过程中,造成碱基插入,缺失,置换突变的因素客观存在,有不少降低发生的频率建议和措施,但是这些措施还停留在实验室阶段,还没有能够应用到规模化生产中。

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