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常见问题

RT-PCR的定义与检测方法

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2021-10-28

什么是RT-PCR,RT-PCR的定义与检测方法。

1.定义:是以RNA为模板,联合逆转录反应(reverse transcription,RT)与PCR,可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的RNA模板。 

RNA扩增包括两个步骤: 在单引物的介导下和逆转录酶的催化下,合成RNA的互补cDNA;加热后cDNA与RNA链解离,然后与另一引物退火,并由DNA聚合酶催化引物延伸生成双链靶DNA, 最后扩增靶DNA。

2.检测方法

⑴一步法:

利用同一缓冲液,在同一体系中加入逆转录酶、引物、Taq酶、4种dNTP直接进行mRNA反转录与PCR扩增。Taq酶不仅具有DNA多聚酶的作用,而且具有反转录酶活性,可利用其双重作用在同一体系中直接以mRNA为模板进行反转录和其后PCR扩增,从而使mRNA的PCR步骤更为简化。所需样品量减少到最低限度,临床小样品的检测非常有利。用一步法扩增可检

测出总RNA中小于1ng的低丰度mRNA.该法可用于低丰度mRNA的cDNA文库的构建及特异cDNA的克隆,并有可能与Taq酶的测序技术相组合,使得自动反转录、基因扩增与基因转录产物的测序在单管中进行。

⑵两步法:

由于单管反应时RT和PCR都不能在最佳条件下进行并且 容易相互干扰,常只适宜用基因特异引物扩增较短的基因,及定量PCR.两步法则是将RT和PCR分别进行,这样使得两个反应充分发挥各自的特点,更为灵活而且严谨,适合那些GC含量、二级结构严重的模板或者是未知模板,以及多个基因的RT-PCR。

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