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常见问题

依赖核酸序列的扩增技术解析,转录依赖的扩增系统

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2021-10-28

依赖核酸序列的扩增技术解析

1.概述:依赖核酸序列的扩增(Nucleic acid sequence-basedamplification,NASBA),又称自主序列复制系统(self-sustainedsequence replication,3SR)或再生长序列复制

技术。1990年Guatelli等首先报道了这一技术.NASBA主要用于RNA的扩增、检测及测序.该反应有赖于AMV逆转录酶,T7RNA多聚酶和核酸酶H(RNaseH)共同协作而完成。

NASBA反应体系中除含有上述三种酶外,还含有核糖核苷,两种特殊的引物和缓冲液。引物I 3‘末端与靶序列互补,5’端含T7RNA多聚酶的启动子,这一引物是用于合成cDNA的.引物Ⅱ的碱基序列与cDNA的5‘未端互补。

2.原理:在NASBA反应时,首先引物Ⅰ与RNA模板复性(结合),AMV逆转录酶催化合成cDNA,RNaseH水解cDNA上的RNA,形成一条单链的DNA;引物Ⅱ随即与此cDNA的5'未端结合,逆转录酶在此DNA模板的指导下合成第二条DNA链.这样形成的DNA双链含有T7RNA多聚酶的启动子.该酶即以此DNA为模板,转录出与样品RNA序列相同的RNA链,而且每条DNA模板在该酶的作用下可合成约100个拷贝的RNA.每条新的RNA又可作为逆录酶的模板合成cDNA.如此反复进行,将获得更多的 RNA和cDNA. 

3.其基本方法为:将引物,标本加入扩增反应液,65℃1min使RNA分子二级结构打开,降温至37℃加入逆转录酶,T7rna聚合酶和RNaseH,并在37℃反应1——1.5小时,其产物经琼脂糖电泳,溴乙锭染色即可在紫外仪下看到条带.NASBA的特点为操作简便,不需特殊仪器,不需温度循环.整个反应过程由三种酶控制,循环次数少,忠实性高,其扩增效率高于PCR,特 异性好. 

转录依赖的扩增系统

1.概述:转录依赖的扩增系统(Transcript-basedamplification system,TAS),是Kwen等人于1989年研究报道的,主要用于扩增RNA.合成A、B引物,引物A的3‘末端与待扩增RNA互补,其5’端有T7RNA多聚酶的启动子信息.逆转录酶以A引物为起点合成cDNA;引物B与此cDNA3‘端互补合成cDNA第二链.逆转录酶除具有逆转录活性外,还有DNA多聚酶的活性及RNaseH的活性.T7RNA多聚酶又以此双链DNA为模板.转录出与待扩增RNA一样的RNA,这些RNA又可作为下轮反应的模板.T7RNA多聚酶的催化效率很高,一个模板可转录10——103个RNA拷贝,因而反应液中待检RNA的数量以10的指数方式扩增.

2. TAS的主要特点是扩增效率高,因为其RNA拷贝数呈10的指数方式增加,只需6个循环靶序列的拷贝数就能达到2×106。它的另一个特点是特异性高,由于TAS只能进行6次温度循环,

错掺率低,加之用葡聚糖珠夹心杂交,因而特异性也高。虽然本法有较高的特异性和敏感性,但其循环过程复杂,需重复加入逆转录酶和T7RNA多聚酶,有待进一步研究。

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