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常见问题

反向PCR与不对称PCR简介

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2021-10-29

反向PCR(Inverse PCR)

1.概述:反向PCR(reverse PCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段,而常规PCR扩增的是已知序列的两引物之间DNA片段.实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切,然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接,再用一对反向的引物进行PCR,其扩增产物将含有两引物外未知序列,从而对未知序进行分析研究.

2.反向PCR的操作流程:扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA,然后用DNA连接酶连接成一个环状分子,通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段。

3.选择多种限制性内切酶的基本准则:是选择不能在非酶切位点切断靶DNA的酶。裂解核心区的内切酶使反向PCR只能扩增引物所定模板(依赖于引物)的上游或下游区,而不裂解核心区的酶则使两侧序列都扩增。Southern杂交来确定内切酶用以产生大小适于环化及反向PCR的片段的末端片段。

不对称PCR

1.概述:不对称PCR(asymmetric PCR)是用不等量的一对引物,PCR扩增后产生大量的单链DNA(SSDNA)。这对引物分别称为非限制引物与限制性引物,其比例一般为50——100:1。在PCR反应的最初10——15个循环中,其扩增产物主要是双链DNA,但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后,非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR 就会产生大量的单链DNA。不对称PCR的关键是控制限制性引物的绝对量,需多次摸索优化两条引物的比例。还有一种方法是先用等浓度的引物PCR扩增,制备双键DNA,(dsDNA),然后以此dsDNA为模板,再以其中的一条引物进行第二次PCR,制备ssDNA。不对称PCR制备的ssDNA,主要用于核酸序列测定。 

原位PCR、重组PCR、多重PCR概述

原位PCR

1.概述:原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应,它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和 高度特异敏感的PCR技术的优点,是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术。原位PCR是Hasse等于1990年建立的,实验用的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落 细胞、血细胞等. 
原位PCR

2.其基本方法为:

①固定组织或细胞:将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上,并用多聚甲醛处理,再灭活除去细胞内源性过氧化物酶.

②蛋白酶K消化处理:用60ug/ml的蛋白酶K将固定好的组织细胞片55℃消化处理2h后,96℃2min以灭活蛋白酶K.

③PCR扩增:在组织细胞片上,加PCR反应液,覆盖并加液体石蜡后,直接放在扩增仪的金属板上,进行PCR循环扩增.有的基因扩增仪带有专门用于原位PCR的装置.

④杂交:PCR扩增结束后,用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交.

⑤显微镜观察结果. 

重组PCR

1.定义:使两个不相邻的DNA片段重组在一起的PCR称为重组PCR(recombinant PCR)。Mullis等于1986年报道了由PCR扩增的两个DNA片段通过重组合后再经延伸而制备出新的DNA分子。

2.其基本原理:将突变碱基,插入或缺失片段,或一种物质的几个基因片段均设计在引物中,先分段对模板扩增,除去多余的引物后,将产物混合,再用一对引物对其进行PCR扩增。其产物将是一重组合的DNA。

3.应用范围:主要用于位点专一碱基置换,DNA片段的插入或缺失DNA片段的连接(如基因工程抗体)。

多重PCR

1.概述:多重PCR(multiplex PCR),又称多重引物PCR或复合 ,它是在同一 反应体系里加上二对以上引物,同时扩增出多个核酸片段的 反应,其反应原理,反应试剂和操作过程与一般 相同。

2.特点:

①高效性,在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物,或对有多个型别的目的基因进行分型,特别是用一滴血就可检测多种病原体。

②系统性,多重很适宜于成组病原体的检测,如肝炎病毒,肠道致病性细菌,性病,无芽胞厌氧菌,战伤感染细菌及细菌战剂的同时侦检。

③经济简便性,多种病原体在同一反应管内同时检出,将大大的节省时间,节省试剂,节约经费开支,为临床提供更多更准确的诊断信息。

3.用途主要有两方面:

⑴多种病原微生物的同时检测或鉴定

①肝炎病毒的感染,在同一病人或同一供血者体内,有时存在多种肝炎病毒重叠感染。

②肠道致病性细菌的检测,如伤寒,痢疾和霍乱,同存一病人并同时发病。

③性病的检测,如梅毒,淋病及艾滋病的诊断。

④战伤细菌及生物战剂细菌的检测,如破伤风杆菌,产气荚膜杆菌,炭疽杆菌,鼠疫杆菌等侦检。

⑤需特殊培养的无芽胞厌氧菌,如脆弱类杆菌、艰难杆菌的鉴定等。

⑵病原微生物,某些遗传病及癌基因的分型鉴定。 

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