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常见问题

pcr技术的三大优势与局限性

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2020-08-20

    PCR技术以其自身巧妙的原理有与众不同的特点,高特异性、高敏感性及简便快捷使其成为基因诊断首选的技术之一。

    一、高特异性,PCR扩增严格遵守碱基配对原则的半保留复制。半保留复制是世界上最严格的复制方式之一,其新合成的子链与模板形成完全互补的镜像结构,从而充分保证了复制的准确性。另外,由于碱基互补原则,只有当引物与目的基因完全互补时,反应体系中的引物才能与模板产生复性,引物的延伸才得以进行,因此引物与模板的互补是复制的最基本条件,这从另一方面规定了PCR反应的高特异性。在生物界中,某种基因总有它最保守的、最具特征性的基因区段,它是某些生物,或某些型、亚型等功能分型所特有的。若能正确地选择这一区域作为扩增的目的基因,便可以充分地保障PCR检测的高度特异性。

    二、高敏感性,在PCR反应中模板DNA以指数级迅速增加,扩增反应前期进入以指数级迅速增加,扩增反应后期进入平台反应期,一般经过30个循环即1——2小时内可以将靶序列增加百万倍以上,可以将微量的目标物(fg DNA)检测出来。过去采用的一些微量检测法,如酶联免疫吸附实验(ELISA)和放射免疫分析(RIA)其灵敏度分别为ng级和pg级,而PCR可达fg级,理论上可以检出病原体的单拷贝基因的存在。

    三、简便快捷,Taq酶的使用使PCR技术可以自动化完成,各种高效荧光定量PCR仪相续问世使PCR操作可以在基层单位的实验室中顺利完成。在PCR的实际应用中,许多技术得到改进,扩增反应体积减少,多种成分预先混合减少加样步骤,这些简化步骤大多不影响PCR的扩增效果。特别是本公司率先研制的单管单人份的PCR试剂,使操作者节省时间精力,而且又不易污染,充分满足了临床快速诊断的要求PCR技术对样品要求低,不必严格纯化模板DNA,几乎所有的临床样本都能用于PCR扩增,本公司设计的一步法提取模板使临床PCR检测更加简便易行。

    PCR局限性,由于Taq酶缺乏3’端到5’端外切酶活性,因而不能纠正反应中发生的错误的核苷酸掺入,复制的新的DNA链中有一定程度的错配碱基,估计错配率为9000个核苷有一个错配,41000个核苷酸可能导致一次码移位。然而错配碱基有终止延伸倾向,这使错配的DNA片段不会进一步扩大。另外,PCR要求比较严格,容易出现实验污染或操作污染而出现假阳性结果。同时如果扩增仪温度不准确,反应液处理不好导致PCR抑制物进入反应体系又会出现假阴性结果。因此在开展PCR工作之前,有关人员最好能经过系统的学习及规范化的基本技能培训过程。

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