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常见问题

PCR技术详解:变性、退火、延伸

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2020-08-20

    PCR技术能快速特异地在体外复制目的,理论上能将其量极微的(fg DNA)目的基因在较短的时间内(1-2小时)扩增到极易检测的微克水平。PCR技术目前已经成为人们获得目标基因的最常用的方法之一。然而其基本原理并不复杂,主要包括模板DNA(目标DNA)加热变性;降温后反应混合物中特异性引物与单链DNA模板的复性;72℃条件下,Taq酶诱导引物借助模板信息由5’端到3’端延伸。每一轮反应,模板拷贝数都增加一倍,理论上n次循环后,扩增产物拷贝数为2E(n——1)。但在PCR反应后期由于底物的消耗,Taq酶活力的下降,PCR抑制物的增加,PCR反应的指数形式逐渐转化为线性形式进入扩增的平台期,实际上30-35个循环,扩增倍数一般可达百万倍。如果想再提高pcr扩增产物的量,可以将产物DNA再稀释1000倍作为新的模板进行第二轮的PCR扩增,一般二次扩增后的DNA数量已达到所有分子生物学操作的要求。

    一、变性

    DNA双螺旋结构的生物功能在于复制与转录,加热或在碱性条件下可以使DNA双螺旋的氢键断裂,形成单链DNA,称之为DNA变性。解除条件后,变形的单链DNA可以重新结合起来,再形成双链,称之为DNA复性,又叫退火。DNA双链离解一半时温度称为解链温度(Tm)。不同DNA的解链温度不同,取决于DNA中G-C与A-T的含量的区别。G-C间有三个氢键,A-T间有两个氢键,因此G-C比例大的DNA片段解链温度高,一般,G-C含量每增加1%,PCR变性温度增加0.4℃。Tm范围通常一般在85-95℃之间,PCR变性温度选择94℃,变性时间为30秒到2分钟。

    二、退火

    PCR反应体系的退火其实是模板与引物的复性。引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。一般引物是人们根据目标DNA的序列人工合成的,其长度在15-30碱基之间,引物的设计有一定的原则,但完全达到理论要求的理想引物,几乎不存在。通常反应体系中包含两个引物所对应的模板区间的DNA片段。由于引物的浓度大大地超出体系中模板的浓度,所以变性后,系统温度降低,首先是引物与单链模板DNA结合,形成局部双链,而不是原来的两条单链模板DNA再结合形成的完整的双链。

    三、 延伸

    PCR中链的延伸是有方向的,以引物为起点,从5’端到3’端延伸,这是由DNA聚合酶(Taq酶)决定的。Taq酶具有DNA多聚酶的核心功能—以DNA为模板,从结合在特定DNA模板上的引物为出发点,将四种脱氧核苷酸以Watson-Crick配对方式按5’—3’的方向,沿着模板顺序合成新的DNA链。Taq酶催化DNA合成的温度以70℃—80℃为宜,此时该酶的Kcat值为150核苷/秒/酶分子,55℃为24核苷/秒/酶分子,37℃为1.5核苷/秒/酶分子,22℃为0.25核苷/秒/酶分子。高于90℃时DNA合成几乎不进行。Taq DNA多聚合酶具有依赖DNA合成的5’端到3’端外切酶活性。但不会影响PCR扩增。Taq酶没有3’端到5’端外切酶活性,所以如果发生脱氧核苷酸的错误掺入时,这种酶没有校正能力。Taq酶对Mg2+离子浓度较为敏感,1.5——2.0mM条件下酶活性最高,许多生物变性剂对酶活性有不同程度的影响。PCR扩增DNA特定区段,是由人工合成的两条寡核苷酸引物所决定的,这是PCR扩增的理论关键。

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