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常见问题

“相对定量”与“绝对定量”的区别,如何选择?

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2020-08-05

    在做荧光定量PCR的时候,我们常听到大家问的一个问题就是“你是做相对定量还是绝对定量?”。今天我们就来了解绝对定量与相对定量的区别,看看了二者有什么异同,我们在做实验的时候到底应该做哪一种呢?

    相对定量

    相对定量,顾名思义,它的结果是一个相对的值,没有单位。与谁相对呢?就是传说中的“内参基因”,又名“持家基因”,即housekeeping gene。

    那为什么在相对定量里一定需要它呢?

    打个比方:假如你要研究某个基因,提取完样品的RNA然后逆转录再做PCR,发现结果是空空如也,那是不是表示样品就没有这个基因呢?其实未必! 因为这里有个两个可能:一是在这个样品中确实不存在这个基因所以你检测不到;二是你的提取操作或者PCR操作出了点问题导致这个基因虽然存在但你在结果中无法发现它。所以要用到内参基因来校正一下。

    常见的内参基因有beta actin,GAPDH等。内参基因就相当于一个标尺,每个目的基因都要用它校正一下才能准确计算出其表达量。比如你要研究几个不同样品中的某个mRNA,但它的表达量可能会因生物体本身的自然状况或者人为的外来干预而表达量有所不同,而从样品中提取出的RNA总量由于操作问题也有可能不尽相同。但由于内参基因的mRNA的表达是很稳定的,你可以理解为它的mRNA在任何时间任何地点都一直有稳定的含量,这个含量在总RNA中的比例是固定的,无论总RNA是多还是少,这个比例是稳定不变的。所以在做PCR的时候,每个样品一定要做一个内参基因的PCR。一个提取良好的样品去做内参基因的PCR是应该一定能做得出来的。这就是传说中的“阳性对照”。而最终你要计算目的基因(可能有多个)的表达量,就是用目的基因的数值,去除以内参基因的数值。一般用RQ(Relative Quantification,相对定量),或者Fold Change来表示。因为得到的数值是个比值,是没有单位的,这就是它的“相对表达量”。

    绝对定量

    另有一些实验则不是这样的,与mRNA无关。

    比如我想知道的是某个基因在DNA水平上它到底有多少个。这时就需要绝对定量了。绝对定量是有单位的,是指在每单位重量或体积的样品中有多少个这个基因。理论上可以具体到个数,但一般来说精确到的“个数”应该不是很可信的,通常精确到数量级(即10的几次方)就可以了。

    那么具体的个数是怎么算出来的呢?这里就要用到传说中的“标准曲线”,也即“标曲”了。说是“曲线”,其实我们得到的是一条直直的线,是直线才能用一次方程来算。

    复习一下初中数学:Y=aX + b。这个方程中有两个未知数:X和Y,还有系数a与截距b。这里Y即CT值,X即拷贝数(图中横座标是对数刻度,即10的几次方)。Y,a,b三个值都可以通过实验结果测得,代入方程,则X值——即拷贝数——就能算出来了。

    这条线又是如何得来的呢?是我们用人工合成的质粒作为标准品,进行梯度稀释作为PCR模板,跑出来的每个结果都在这个图中对应一个点。几个点都画在图中,基本上成一条直线。这条线有一个回归系数(即R²),这个值越接近于1,说明这几个点的连线越直,计算出的结果越精确。

    当然上面说的是原理,事实上不用我们手工去计算。现在的qPCR软件可以直接帮我们导出现成的结果。

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