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常见问题

教你如何使用NCBI设计引物

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2020-08-03

    在用NCBI进行引物设计之前,我们先要熟悉一些NCBI的基础知识。NCBI中有很多以两个字母开头,然后下划线后跟一组数据的符号。我们有必要对这些符号有一个最基本发认识,这将对我们后面进行引物设计时选择正确的模板序列有至关重要的作用。选错了模板序列,后面的实验都将出现问题。本文中将涉及到三个NCBI的标记类别,分别做如下说明:

    NM_123456:mRNA ,转录组产物序列;成熟mRNA转录本序列;

    NC_123456:genomic,完整的基因组分子序列,标记的类别包括基因组、染色体、细胞器、质粒;

    NP_123456:protein,蛋白产物;主要是全长转录氨基酸序列,但也有一些只有部分蛋白质的部分氨基酸序列;

    注:123456是泛指。

    引物设计原则

    1、引物长度一般在15-30bp。常用的为18-27bp,但不应大于38bp,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA聚合酶进行反应;

    2、引物GC含量一般为40%-60%, 45-55%为宜,GC含量过高或过低都不利于引发反应。上下游引物GC含量和Tm值要保持接近;

    3、引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右。至少要在55-80℃之间。

    4、引物3’端的碱基一般不用A。A在错误引发位点的引发效率相对比较高。引物3’端出现3个以上的连续碱基,如GGG或CCC,或者引物3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。

    5、碱基要随机分布,且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。

    6、 尽量在Exon junction上设计引物,限制基因组DNA扩增。

    7、 使用BLAST检索,确认引物特异性。

    NCBI查找目的基因

    1.打开NCBI网页,在搜索栏里输入基因名称和物种,前面的下拉框选择  Gene,选好之后点击搜索
    使用NCBI设计引物

    2.搜索之后会出现以下界面,我们要看物种信息和我们基因名称是不是我们需要的基因,红色方框圈出来的地方就是我们的目标基因,找到之后点击左边的基因名称
    使用NCBI设计引物

    3.点击之后会跳出基因的一些基本信息,这个时候可以再次核对是不是自己的目标基因
    使用NCBI设计引物

    4.确认无误之后往下拉找到该基因对应的核酸信息,找到之后点击方框中的核酸信息
    使用NCBI设计引物

    5.点击之后就能看到对应的mRNA的序列信息,选择自己需要的一段碱基序列进行设计引物就可以啦
    使用NCBI设计引物

    往下拉就能看到基因序列了
    使用NCBI设计引物

    注:经常用到NCBI,最好注册一个NCBI账号。

    引物设计各参数设定

    0)、序列输入处

    有三种序列输入方式:

    基因序列号,如 NM_001289746.2

    文本序列,即一段含AGCT的DNA序列

    从文件中上传序列(Fasta格式)

    1)、引物区域设定

    这里我们可以指定上下游引物在什么区域,这里面指定的区域不能与其他参数冲突。

    如上图中填入的650,说明forward primer在基因的650bp之前。其他的设定方法大家可以开动脑筋设定出自己想要的参数。参数设定得很严格,可能出不来引物序列。

    2)、引物相关参数设定

    针对qPCR引物,我们建议将引物长度设定在200bp以内,最好别超过150bp。定量PCR产物原则上宜短不宜长。

    默认的Tm值通常不做修改。以60℃为基准,与后面qPCR实验中用60℃做退火温度匹配

    3)、参考数据库

    这里要正确选择,主要涉及到设计的引物特异性问题。一般针对mRNA序列做模板,选RefSeq,针对基因组DNA做模板,选Genomes。

    4)、Organism

    选择正确的物种。如果是从NCBI选中的序列直接到该页面的,则该处直接有默认的选择。否则如果是自己输入的序列,则要在该处自己输入物种名称。

    此处输入正确的物种名,以缩小引物特异性比对时的范围,使引物设计更快。

    5)、 Show results in a new window,勾选此项。这样结果不好时方便回来修改参数重新设计。

    设定好上面的参数,点击“Get Primers”,即可在新的窗口中显示出引物设计结果。根据设定的参数情况,出结果的速度快慢不一。

    下面两张图比较的是基因组DNA序列和mRNA序列设计引物的不同结果样式。其中mRNA序列为模板设计的引物,各外显子是紧密相邻的,而基因组DNA设计引物,各外显子是被内含子隔开了。

    使用NCBI设计引物
    上图以基因组DNA为模板(NC_000012.12),外显子之间有内含子隔开。
    使用NCBI设计引物

    上图以mRNA为模板(NM_001289746.2)设计的引物结果。图中各外显子是连在一起的。
    使用NCBI设计引物

    从上面设计结果中选择出我们所需要的引物对,将引物的参数复制保存起来备用。

    如何选择扩增引物对,我们有如下建议:

    1)、优先选择扩增片段短的引物对,一般扩增效率高。

    2)、最好其中的一条引物能够跨两个外显子,这样可以在理论上解决所提取的RNA中污染的基因组DNA对扩增的干扰。

    3)、其它的一般没有什么特殊要求。

    其实PCR扩增是一个比较简单的事情,只要用常规质量的引物和试剂,都可以得到比较好的结果,成功率达到80%以上。

    小贴士:如果实验比较急或比较重要,一个基因建议在不同位置选择两对引物同时合成和调试,提高实验成功率并可以选择一个扩增结果好的引物对,提高实验数据质量。

    参考文献:

    NCBI网站:https://www.ncbi.nlm.nih.gov

    今天的软件说明你学会了吗?快找一个基因设计一下自己的吧!!!

    NCBI是一个非常强大的数据库和功能软件,作为从事分子生物学的人员,花一些时间研究一下NCBI的基本功能,是一件非常值得的事情。

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