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常见问题

特异引物与简并引物两者的区别是什么?

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2020-08-02

    我们在设计引物的时候,经常听到“特异引物”与“简并引物”(也有写成“兼并引物”)这样的说法。那么这两者有何异同呢?分别适合什么情况呢?今天我们就带着大家一起来学习一下吧纯干货分享!

    特异引物

    多数情况下,我们要研究的基因序列都能在数据库中找到现成的序列。如果你要得到某一段序列的话,针对这个序列设计引物就行了。这样得到的引物每一个位置上的碱基都是确定的,这样的引物就叫“特异引物”。特异引物由于碱基是确定的,所以由这个序列所计算出的Tm值以及PCR退火温度都是确定的。一般特异引物的退火温度在55-60度是比较常见的。

    说完特异引物接下来我们一起来看看简并引物是什么吧(内容比较长,请耐心看完哦)

    简并引物

    有些时候,我们在研究某个不是很常见的物种的某个基因时,我们事先并不知道它的基因序列是什么,而到NBCI等网上数据库也查不到,但你的任务是要把这个基因PCR出来。该怎么办?(恭喜你,你可能成为世界上第一个知道这个基因序列的人,你可以提交到GenBank,你的名字也会出现在GenBank)。你要做的是:参考几个近缘物种的同名基因的序列,来设计这个未知序列的引物。通常是多找几个亲缘关系较近的放在一起做比对,选择其中同源性最高的片段来设计引物,这样至少可以得到一个确定的片段。话虽简单,但这样有可能碰这样的情况:虽然几段基因同源性较高,但区别仍是有的。有可能你无论如何怎么选,都无法在几个序列中找到两段足够长(20个碱基左右)的、同源性100%的、GC含量合适的序列来作为一对引物序列。这时,你就要退而求其次,允许在这20个碱基左右的片段内出现若干个不确定的碱基。

    比如,根据已知序列比对的结果,在引物第3个位置上可能是A,也可能是C,甚至也可能是T,那么你就可以在这个位置上设计为A/C/T简并。也就是说,你拿到手的引物,在第3个位置上即有A碱基,也有C碱基,也有T碱基。同理,在同一条引物中,可存在N个这样的简并位点。这样,虽然在理论上你不知道你的目的基因在这个位点上到底应该是哪个碱基,但因为简并碱基的存在,总会有一个是刚好匹配的,这样就能进行PCR反应了。但要提醒的是:简并位点不宜过多,否则会导致有效序列的引物含量低,最终导致PCR的产物量少,条带的亮度弱。

    对于简并碱基,我们通常用一个字母来代替A/C/T这样的写法。标准简并碱基代码如下表:
    标准简并碱基代码

    由于目的基因序列整体是未知的,所以在用简并引物做PCR时设定退火温度时不要太高,这样有利于PCR得到目的片段,但也增加了扩增到杂带的可能哦。

    另还有一种解决方法,就是引入I碱基(大写字母i),即次黄嘌呤。这个I有个特性,就是可以与A、 C、 T、 G这四种碱基中的任何一个配对。这样,你也可以将未知碱基设计为I,这样也会发生正确的PCR反应。而你在测序时会测到这个位置的正确碱基,即A、C、T、G中的某一种。这样你就知道这个位置上到底是什么了。

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