荧光定量PCR引物探针的设计方法

作者：荧光定量PCR仪   发布时间：2020-08-01

    前几次我们一直聊到的都是普通引物的设计相关知识，今天，我们就来聊聊荧光定量PCR引物探针的设计方法，让我们一起荡漾在知识的海洋里吧。

    自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系。
    

    我们在进行荧光定量PCR时，荧光信号的来源一般有两种：一是使用荧光染料，即我们常见的SYBR Green I。二是使用荧光探针。其中染料法成本低，但对目标片段的识别并无特异性，从而有时会发现结果不是很准确。所以我们也会采用第二种发光方式，即荧光探针。

    荧光探针，事实上也就是一小段单链DNA，与引物相似，区别是在5’与3’端分别多加了荧光标记的化学基团。这种探针类型通常称之为TaqMan探针。探针序列与目的DNA的序列是严格互补配对的。理论上只要有一个碱基不匹配，探针就不能与序列相结合，从而也就不会有荧光信号了，这样精确度更高，不会有非特异性的荧光出现。

    Taqman探针特异性强灵敏度高，条件优化容易；而且相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，也能完成基本的定量PCR要求。当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。

    探针设计总体原则：

    1. 先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。

    2. 所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。

    3. 扩增长度应不超过400bp，理想的扩增长度在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。

    4. 保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。

    5. 为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G） 。

    6. 将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。

    在原理上与引物设计是比较类似的。只是因为探针序列要求匹配度很高，所以对于探针的GC含量和Tm值都是有严格要求的，而且还要考虑到与上下游引物相匹配。假如你手头已经有了染料法的引物，然后想仍然使用这一对引物、在这一对引物对应的序列中间选一段作为探针可以吗？我们不建议这么做。因为你单独设计的上下游引物没问题，单独设计的探针看起来也没问题，但把引物与探针放在一起，就有可能出现参数不兼容的问题。所以还是三者放在一起设计才好。
    

    在我们常接触到的探针家族中，有一种是稍特殊的，就是传说中的MGB（Minor Groove Binder）探针。

    MGB探针由于其化学结构的特殊性，它的匹配更严格，精确度更高。假如你需要用探针法来检测单碱基的突变时，MGB探针就很合适。MGB探针Tm值更高，片段稍短。MGB探针有独特的设计软件，如Primer Express 3.0等。可直接为您设计出符合需要的引物/探针序列。一般MGB探针的Tm值要比引物的高5——10度，要注意这一点。

    有人可能会以为：我用常规设计软件设计出一个TaqMan探针序列，然后去掉几个碱基、再改为MGB标记可以吗？我们不建议这么做。因为这样得到的序列未必符合MGB标记的要求。