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常见问题

在做荧光定量PCR时,荧光基团如何选择?

作者:捷瑞   发布时间:2020-07-31

    今天我们要讲到的是荧光基团的选择,我们在做荧光定量PCR时,有时会使用带有荧光基团的探针或引物,有时为了检测多个目标会设置不同荧光基团标记的荧光探针。那么常见荧光基团有哪些?原则上又该如何选择呢?

    原则一

    每个反应只检测一个基因的,方法就比较简单,对5’端荧光基团的选择以及3’端淬灭基团的选择余地都是比较大的。比如5’-FAM  +  3’-BHQ,就是比较常见的方案。

    下表为常用荧光染料(基团)的颜色及波长参数,供参考。
    常用荧光染料的颜色及波长参数

    原则二

    如果在每个反应中要检测的目的基因不止一个,那么尽量选择波长区别较大的发光基团。

    一般荧光定量PCR仪常有数个不同的荧光通道。理论上可以通过设置不同的荧光基团、从而达到在一个孔里内同时检测多个基因的目的。

    上表中给出的数值只是波长峰值,事实上每种荧光都是呈正态分布的,都有一定的带宽,互相之间都会一些或大或小的交集(见下图)。也就是说,如果两个通道峰值波长相差不是很大的话,是有可能在此通道中检测到另一个通道的荧光值的。所以在选择荧光基团的时候要注意这一点。尽量选择波长差距较大的通道,这样可以尽量避免不同荧光通道之间的互相干扰。
    荧光通道

    原则三

    ROX可能要特殊考虑。有些型号的荧光PCR仪会使用ROX通道来进行光学校正,通常会占用一个ROX通道。比如ABI公司的某些型号的荧光定量PCR仪就是这样的,所以在选择荧光基团时要注意这一点。而伯乐、罗氏等公司的仪器由于设计原理一般不需要作此考虑。这里就请您先了解一下您的仪器型号了

    原则四

    淬灭基团的选择要与发光基团相对应。并不是所有的发光基团都可以用同一个淬灭基团来“统一”淬灭的。每种发光基团都有自己相对应的最适合的淬灭基团。下图列出了常见发光基团与淬灭基团的对应关系。
    常见发光基团与淬灭基团的对应关系
     以上就是有关在荧光基团的选择知识,在做荧光定量PCR时,荧光基团选择可以参考上面整理的四个原则。

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