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常见问题

lncRNA与microRNA引物的设计

作者:捷瑞   发布时间:2020-07-30

    今天我们来来说下pcr引物设计相关的内容,今天我们说的是lncRNA与microRNA引物的设计,首先要知道什么是lncRNA,以及如何做做miRNA的PCR?一起来看看吧。

    关于lncRNA与microRNA引物

    我们平时所说的“基因”,以前多半是指在mRNA水平上的核酸片段。但随着分子生物学的日益发展,我们的研究对象也渐渐多了起来,近年已经不局限于mRNA这一种。比如这几年火热的非编码RNA——比如lncRNA与microRNA——也常是我们研究的对象。那么在研究lncRNA与microRNA,PCR引物又该如何设计呢?

    lncRNA,即Long non-coding RNA,你可以把它理解为不表达蛋白的mRNA。它的很多特征与mRNA很类似。比如,它与mRNA一样有启动子、有polyA尾巴、有不同剪接、有动态表达水平。除了不表达蛋白这一点以外,仅从核苷酸水平上来看,可以说它与mRNA并无实质分别。所以对于设计PCR引物,你可以用设计常规mRNA基因引物的方法来设计引物。(提示:lncRNA一词,发音类似于Link RNA。第一个字母是L,不是大写的i)
    lncRNA

    另一种我们最近常研究的microRNA(简称为miRNA),也是非编码RNA的一种,只不过其长度较短,成熟体一般也就22个碱基左右。下图是miRNA的形成过程示意图:
    miRNA的形成过程

    想要做miRNA的PCR,一般有两种方法

    加尾法和茎环法

    加尾法,是指把miRNA再人工加一个polyA的尾巴,这样它的结构就变长,有点象是典型的mRNA结构。很多公司提供有现成的miRNA加尾法逆转录试剂盒。按常规方法提取总RNA,用于逆转录。做完逆转录后,可参考的方法去做PCR。注意,这时的PCR需要的上下游引物,一般是上游引物就直接用miRNA的序列(把U换成T即可),下游引物则要参考逆转录试剂盒的加尾,一般由逆转录试剂盒的同家公司特殊提供。原理见下图。
    mRNA原理

    茎环法也是一种很常见的方法。它是模拟miRNA在形成过程中的茎环结构(Stem Loop),在逆转录过程中把miRNA成熟体序列加长,同时其序列内部互相配对形成茎环结构。

    注意!!!使用茎环法做PCR时,需要三条引物:茎环引物、上游引物、下游引物。

    茎环引物用于做逆转录操作,可用普通逆转录试剂盒,但不需要试剂盒中的逆转录引物(因为那是为mRNA准备的,miRNA用不到),同时必须使用茎环引物作为逆转录引物。每个茎环引物都是为目的基因设计的。也就是说,你要检测哪个miRNA,就必须使用对应的特殊茎环引物。这个茎环引物是特异的,只针对这一个miRNA。所以得到的cDNA也只能用于检测这一个miRNA,不能用于检测别的miRNA。你要检测多少个miRNA,就需要对应制备多少个cDNA。它不象mRNA逆转录得到的cDNA是通用的,可以用来PCR任何一个基于mRNA序列的基因。

    上游引物与下游引物就是用于PCR反应的。一般上游引物也是基于miRNA成熟序列来设计。而下游引物则是基于茎环序列来设计的。茎环法的好处是加长的序列足够长,所以有足够的长度空间来设计引物,针对不同退火温度还可更换不同的茎环序列。而且此结构也便于设计探针。因为miRNA的定量如果用染料法不容易做到特别精确。如果要求高精确度的话还是推荐探针法

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