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常见问题

PCR实验内参基因的选择

作者:捷瑞   发布时间:2020-07-29

    “内参基因”是我们在做PCR时常碰到的一个名词。它到底是什么,又有什么用呢?内参基因(housekeeping gene),又名管家基因、持家基因,是指一类在生物体内有稳定表达的基因。一般用于实验时的内部参照,即Internal Control。可以认为是一种在各种情况下,在各种不同组织、在不同时间点、各种不同外界及内部情况下,表达都很稳定的基因。在PCR实验时常需要设置内参基因。

    β-actin,细胞骨架蛋白就是这样一种管家基因,它是细胞骨架微丝的基本构成单位,在各种细胞中表达一般恒定而较少变化,所以常用作PCR的内参。除β-actin 外,还有一种GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)也是常用的内参基因。它是参与糖酵解的一种关键酶,几乎在所有组织中都高水平表达。

    除了以上两种内参基因,还有其他一些种类的内参基因也是常用的,如EF-1α,18s rRNA等。原理都是类似的。

    内参基因的作用

    1. 判断样品提取是否成功。假如你提取了总RNA然后再做逆转录得到cDNA,然后再去跑PCR发现没有结果,是不是表示样品中没有你的目的基因呢?答案是:不一定。要根据使用同一模板跑出的内参基因的结果才可判断。内参基因的CT在一个合理范围(比如20左右)的前提下,才能说明样品制备没问题,在这个前提下,做出来的结果才是可信的。

    2 .(这条是最重要的!)用来计算目的基因的表达量。在进行相对定量PCR时,所有的目的基因都要经内参基因的校正后才能进行比较,因为每个样品的提取效率都可能不同,所以不能简单的把每个PCR结果的CT值直接进行比较,这样是没有意义的。只有把目的基因的表达量与内参基因的表达量相除以后得到一个比值、然后把这个比值进行比较,才是有意义的,而且这个比值可以量化,最终得到表达量的RQ值。

    3. 与熔解曲线相对照。有时我们会发现染料法qPCR的熔解曲线很差,并非单峰,这时先不要确定是引物的问题,还要先看一下内参的CT。假如内参的CT值很高,超过30,而目的基因的CT值很大甚至接近40,则说明模板浓度过低,导致出现非特异性扩增的可能性增加、而目的片段含量过少。解决方法是要重新制备PCR模板。

    那么,在检测基因表达量的时候,设一个内参就够了吗?

    原则上,是的。但也有些很严谨的同学,在做PCR实验时会同时设置不止一个内参。理想的情况是:在同一批实验中用不同的内参计算出的结果基本一致,这当然是最好的结果。但也有可能出现使用不同内参计算出的结果差异较大的情况。这种情况也是偶有出现的。这时你可以看哪一个结果与你预期最接近,就选哪一个。至于原因就比较复杂。一般认为,即使是内参基因,在某些特定条件下其表达量也不是那么铁板一块、永远不变的。所以完美的内参只存在于理论中,实际不会那么完美,还是有一些缺陷的。

    在进行microRNA的PCR时,不能照搬使用上面的β-actin、GAPDH等内参基因。因为microRNA的表达模式与mRNA是不同的。microRNA有其特定的内参基因,比如U6,5S等。

    在做绝对定量PCR时,一般是不需要内参基因的。另在蛋白印迹实验(如western blot)时也常需要设置内参基因。这里虽是指在蛋白层面上的内参,但在原理上是异曲同工的。

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