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常见问题

PCR实验之前的准备工作有哪些?

作者:捷瑞   发布时间:2020-07-28

  我们常碰到这样的情况:第一次PCR实验前信心满满,但实验结束后发现结果不那么完美,结果与事先的预期差距挺大、甚至相反,更甚至可能连一点结果都没有。这非常打击实验的热情。事后总结一下,我们可能会陆续找出原因:哦,引物设计可能有点问题,导致有非特异性的扩增,然后那个退火温度可能也不太对,哎,早知道我把温度降低一点就好了……

  以上种种报怨,其实是可以避免的。我们当然希望实验一次成功,但也别指望你的实验方案就那么完美、每次都能一次成功。俗话说,磨刀不误砍柴功。事先花一点时间做好功课,工作效率就会大大提高。多花这一点时间,会比你实验失败后一头雾水找原因 + 调整方案 + 重新加样做实验……所花的时间要少得多。尤其是实验样本很珍贵的情况!!!预实验真的非常非常的有必要哦

  pcr实验前都要做什么呢?

  首先从引物说起。

  1. 判断引物序列好坏

  使用软件设计出来的引物,一般都是比较中规中矩的。但也不能简单的认为软件设计出来的引物就一定没问题。最好还是要分析一下的。现在很多DNA类的软件都有判断引物好坏的功能。以软件DNAstar的PrimerSelect为例。判断引物序列好坏的指标主要有3个:

  1.1 Self Dimers(自聚体)

  1.2 Pair Dimers(二聚体)

  1.3 Hairpins(发夹结构)

  很多软件都有这样的功能,可根据你的引物序列来判断引物的好坏、给出评分。当然,这个分析仅是在理论上,供参考的。有时软件认为“不好”的引物对,比如犯了以上三个禁忌之一甚至全部三个,但实际做实验也能做出来。

  2. 先做个常规PCR。

  对,你没看错,是常规PCR。建议您使用与qPCR相同的循环参数,去跑个常规PCR。不必使用所有的样品,只用少量样品,但所有的引物建议都用。实验结束后跑个电泳,看目的条带是否足够亮,是否单一,是否有杂带。如果有杂带(比如引物二聚体),说明这对序列可能不太好。需要重新设计、更换序列,或者调整一下PCR循环参数,找到合适的参数后,后面做qPCR时就可作为参考。

  3. 也可以直接用qPCR做个小型预实验。

        同样是使用少量样品,但建议使用全部引物。实验结束后检查扩增曲线、尤其是熔解曲线是否正常。这样可能判断你的样品DNA浓度是否在合理范围内、引物设计是否完美。
    扩增曲线
    扩增曲线

  笔者在读书时,实验室的师妹曾为了检测某个基因,反复设计、验证引物,直到第12次时才得到完美的引物方案。所以关于重新设计引物这事,其实没什么大不了的。为了实验结果的完美,这是很常用的手段。

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