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常见问题

PCR实验的分组设计和样品的取材

作者:捷瑞   发布时间:2020-07-27

  实验分组

  我们常听到“这个实验你设了几个重复?”或者“你这个PCR是几复孔?”这样的说法。那么在实验中,不同的“重复”有什么不同含义?应该怎么去设计呢?

  在统计学上,单个样品得到的结果可信性不高,因为孤例不足信。只有当你重复出同样的结果来,这个结果才有可信性。一般同类样品至少重复3次的结果才有说服力。有时为了精确,重复数甚至可以更多、远不止3个。但如何设计出这么多重复来呢?

  假如你养细胞,共3个培养皿,每个皿中都是相同的细胞、做相同的处理。然后各自独立收集3个皿中的细胞,得到3个样品管,编号为1、2、3号。这叫生物学重复。在生物学上这3个样品应该具有先天相同的特征。生物学重复互相之间有误差是正常的。生物学重复是为了校正样本间天然存在的误差。

  然后这3个样品各自独立的去抽取RNA、制备为模板,然后去做PCR。在PCR加样的时候,每个样品又再次分为3份,每一份单独加到一个样品孔中。这叫实验重复(也叫技术重复)。这样就叫做3复孔。我们得出的每个样的最终的CT值,事实上是3个孔的平均值。一个正常的PCR,3复孔之间的误差应该是很小的。否则就说明加样操作有问题了。实验重复是为校正实验操作过程中的人为误差。

  PCR中还通常设有NTC,意思是完全没有样品的对照孔(相当于空白孔)。理论上这样的孔应该是没有读值的。

  同时,别忘了设对照组样品。如果没有对照组,仅用实验组的数据就很难说明问题。
       设对照组样品

  生物学重复与技术重复的意义是不一样的。有兴趣的同学可以去研究一下统计学。虽然统计学属于数学范畴,但在生物学领域也是经常会用到的。实验的设计不能违反统计学原理。

  样品采集、保存、运输

  大家都知道,用于实验样品当然是越新鲜越好。但采集好的样品后如果来不及马上做实验,就要先保存一段时间。首选当然是低温保存的方式。对于要提取RNA的样品,保存条件比较严格。有条件的,先用液氮处理,然后-80度保存。这是最稳妥的保存方式。如果还要运输,最好用干冰,即防样品变质,又方便运输。

  对于提取RNA的样品,如果不具备以上条件,也有其他办法,比如把样品浸泡在RNA样品保存液里,或者Trizol中,也有助于保存样品。

  对于提取DNA的样品,条件可以稍放宽些。但-20度保存也是必需的。运输时如果没有干冰,用事先冻好的冰袋也是可以的。

  还有一些特殊样品可能不适合零度以下保存。比如全血或者某些血细胞就需经抗凝血处理后保存于2-6度。这类样品的保存一定要参考业内的专业操作规程。

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