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常见问题

RNA抽提、逆转录(RT)、聚合酶链式反应(PCR)、电泳鉴定

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2020-07-24

    RNA抽提
    一,准备工作

    1, 实验器具与材料:

    RNA 抽提

    (1) 移液枪:1ml、200ul、10ul

    (2) 吸头:1ml、200ul、20ul

    (3) 吸头台:放置1ml吸头的一个,放置200ul和20ul的吸头一个 (4) EP管1.5ml、100ul

    (5) 玻璃研磨器

    (6) 容量瓶:1000ml

    (7) 盐水瓶:100ml

    (8) 15ml塑料管一个(配75%乙醇用)

    2, 实验器具的处理与准备

    (1) 塑料制品:(包括吸头、EP管等)

    将塑料制品逐个浸泡于 1‰DEPC 水中(必要时小枪头需要用吸管打入 DEPC 水)37°C过夜,然后送至高压 3 次,后在 80°C烘烤箱中烘干(或置于 37°C中 8 小时左右烘干),试验前将枪头放入吸头台。

    (2) 玻璃制品:(主要是玻璃研磨器)

    先泡酸过夜,冲洗干净后,在 1‰DEPC 水中泡 8 小时左右,37°C烘干,用蒙锡 纸包裹送至干烤 3 次。

    (3) 金属制品:(镊子等)

    先洗干净,再送干烤 3 次。(不需要泡 DEPC 水)

    3, 试剂配制和准备:

    (1) DEPC水:泡实验器具的DEPC水的配制:1000ml双蒸水中加1mlDEPC,放在

    1000ml 容量瓶中静置 4 小时后备用。配 75%乙醇的 DEPC 水的配制:100ml

    盐水瓶内装 40ml 双蒸水,加 40ulDEPC,37°C过夜,送至高压。

    (2) 75%乙醇(要在抽提时现配):用无水乙醇和DEPC水配制(DEPC水:无水乙

    醇=1:3),然后放于-20°C备用。

    (3) 异丙醇:放入棕色瓶

    (4) 氯仿:放入棕色瓶

    (5) Trizol:100ml/瓶 存放于4°C

    二,抽提时注意事项:

    全程佩戴一次性手套和口罩,手套要勤换,避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。

    三,抽提步骤

    1. 匀浆化作用

    取约 100mg 鼠脑组织放于玻璃研磨器内,先加 0.2ml 的 Trizol 溶液,研磨组织后,倒 入 1.5mlEP 管中,再在研磨器内加入 0.8ml 的 Trizol 溶液洗,后全部再倒入 EP 管中。 颠倒混匀 10 下,室温静置 5 分钟。

    2. 分离阶段

    每 1mlTrizol 中加 0.2ml 氯仿。盖紧样品管盖,用手用力摇晃试管 15 秒,使其充分混匀, 室温静置 5 分钟。后 12000rmp 离心 15 分钟。

    3. RNA 的沉淀

    将上层水相转入新的 1.5mlEP 管中(约 400-500ul),加入 0.5ml 异丙醇,混匀后放于-20 °C中 1 小时,后 12000rmp 离心 10 分钟。

    2

    6,RNA 的保存

    提取的 RNA 保存于-70°C超低温冰箱中,或立即用于逆转录。

    组织 100mg

    ↓

    加 1mlTRIzol

    ↓

    匀浆(要彻底,后转至 EP 管) (组织匀浆量>100mg 时分装 1ml/每 EP 管)

    ↓

    颠倒混匀 10 下,室温 5 分钟

    ↓

    加氯仿 1/5 体积(0.2ml)(必须按总体积的 1/5)

    ↓

    颠倒混匀 15S,室温 5 分钟

    ↓

    4°C,离心 12000rmp,15 分钟

    ↓

    转上层水相(约 400-500μl)于另一新 1.5mlEP 管中

    ↓

    加等体积异丙醇(约 400 -500μl),混匀后-20°C中 1 小时 ↓

    4°C,离心 12000rmp,10 分钟

    ↓

    弃上清

    ↓

    加冰预冷的 75%乙醇(用高压后的 DEPC 水配)1ml

    ↓

    4°C离心 7500rmp,5 分钟

    ↓ 弃上清,超净工作台开风机干燥约 30 分钟(不能完全干燥) ↓

    溶于 DEPC 水中至 20μl(10μl-20μl)

    (可在 55-60°C水中,<10 分钟助溶)

    ↓

    立即保存于-70°C超低温冰箱中,或立即用于逆转录

    细胞 1×107

    3

    4. RNA 的洗脱

    小心倒掉上清,留取沉淀。加 1ml 现配的 75%的乙醇(预冷)振荡洗涤 RNA 沉淀一次, 后 7500rmp 离心 5 分钟。

    5. RNA 的再溶解

    小心倒掉上清,取沉淀置超净工作台开风机吹干(约 30 分钟,此时 RNA 沉淀变透明)。 注意不能让 RNA 沉淀完全干燥(会极大地降低它地可溶性)。再在管中加 20ul 的 DEPC 水溶解,在 55-60°C下孵育 10 分钟助溶。

    TRIzol 法抽提总 RNA

    细胞用 1ml 加样 器吹至液体澄清 且无细胞团块

    逆转录(RT)

    一,准备工作

    1, 实验器具与材料: (1)移液枪:200ul、10ul (2)吸头:200ul、20ul (3)EP 管 1.5ml、100ul (4)水浴箱 2,实验器具的处理与准备

    逆转录(RT)

    塑料制品:(包括吸头、EP 管等)

    将塑料制品逐个浸泡于 1‰DEPC 水中(必要时小枪头需要用吸管打

    入 DEPC 水)37°C过夜,然后送至高压 3 次,后在 80°C烘烤箱中烘干(或置于

    37°C中 8 小时左右烘干),试验前将枪头放入吸头台。 3,试剂配制和准备:

    (1)DEPC 水:泡实验器具的 DEPC 水的配制:1000ml 双蒸水中加 1mlDEPC,放在 1000ml 容量瓶中静置 4 小时后备用。逆转录中所用的 DEPC 水的配 制:100ml 盐水瓶内装 40ml 双蒸水,加 40ulDEPC,37°C过夜,送至 高压,后分装到几个 1.5mlEP 管中,-20°C中保存备用。

    (2)RT 中所需要的各种试剂 (3)引物浓度计算方法: (新合成的引物的稀释)

    假如终浓度为X uM(pmol/ul)

    加DEPC水体积(ul)=(OD×33×1000000)/(分子量×X) 二,RT 时注意事项:

    为避免 RNA 酶污染,在 RT 中仍要佩戴一次性手套和口罩。 三,RT 步骤

    用 SSIII逆转录酶进行 RT(20ul 体积)

    1, 准备0.65ml的EP管

    2, 冰上操作:在EP管中加入10ulDEPC水,1ul引物,1ul模板RNA,1uldNTP,短 暂离心。

    3, 65°C水浴5分钟后,立刻0°C冰水浴至少1分钟。

    4, 短暂离心后,冰上操作:加入4ul5×First-StrandBuffer,1ul0.1MDTT,1ulRNAse Inhibitor,1ul SSIII逆转录酶。

    5, 短暂离心

    6, 50°C水浴60分钟进行逆转录。

    7, 70°C水浴15分钟灭活逆转录酶

    8, -20°C保存,或立即进行PCR。

    用 AMV 逆转录酶进行 RT(10ul 体积)

    1, 准备 0.65mlEP 管

    2, 加入 4.5ul DEPC 水,1ul 引物,1ul 模板 RNA

    3, 稍离心,100°C沸水裕 1min

    4, 加入 0.5uldNTP,2ul 5×Buffer,1ul AMV 逆转录酶 5, 稍离心,封口膜封口,42°C水浴 90°C作 RT

    6, 100°C沸水裕 3min 灭活 AMV

    7, 立即 PCR 或-20°C保存。

    聚合酶链式反应(PCR)

    二,准备工作

    8, 实验器具与材料: (1)移液枪:200ul、10ul (2)吸头:200ul、20ul

    (3)吸头台:放置 200ul 和 20ul 的吸头一个 (4)EP 管 1.5ml、100ul

    2,实验器具的处理与准备

    (1) 塑料制品:(包括吸头、EP 管等)

    送至高压 3 次,试验前将枪头放入吸头台。 3, 试剂配制和准备:

    (1) 双蒸水: 100ml 盐水瓶内装 40ml 蒸馏水,送至高压,后分装到几个 1.5mlEP 管中, -20°C中保存备用。

    (2) PCR 中所需要的各种试剂 三,PCR 时注意事项:

    佩戴一次性手套,同时避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。

    四,PCR 步骤

    1, 准备 100ul EP 管

    2, 依次在管中加入:(50ul 反应体系)

    ddH2O

    10mM dNTP

    10×PCR buffer

    25mM Mgcl2 (加之前要摇匀) 上游引物

    下游引物

    模板cDNA 1ul

    3, 稍离心

    4, 100°C沸水浴 1 分钟

    5, 趁热加入 Tag 酶 0.5ul(冰上操作) 6, 再加入 50ul 液体石蜡封闭

    7, 10000rmp 离心 1 分钟

    8, PCR 条件

    94°C 1min

    58°C 50sec

    72°C 1min30sec

    进行 40 个循环,然后 72°C 10min 完后 4°C保温。

    9,10000rmp 离心 5min

    10,将下层水相转入新的 0.65mlEP 管中,-20°C保存。

    电泳鉴定

    一,准备工作

    1,实验器具与材料:

    (1)移液枪:10ul

    (2)吸头:20ul

    (3)吸头台:放置 200ul 和 20ul 的吸头一个 (4)三角烧瓶:50ml 一个

    (5)琼脂糖 2,实验器具的处理与准备

    (1) 塑料制品:(包括吸头等)

    送至高压 3 次,试验前将枪头放入吸头台。

    (2)电泳板及电泳槽: 用自来水冲洗干净备用

    3, 试剂配制和准备:

    (1) 电泳缓冲液(TAE):

    先配制 0.5mol/L,PH8.0 的 EDTA 溶液:将 37.2g EDTA-Na 加入 160ml 蒸馏水中, 在搅拌器上剧烈搅拌。在用 NaOH 调节溶液 PH 值至 8.0(约需 4gNaOH)。用蒸馏水 定容至 200ml。后送至高压灭菌。室温保存。

    再配制 50×TAE 溶液:在 400ml 蒸馏水中溶解 121g Tris 碱,加入 28.55ml 冰乙 酸和 50ml 0.5ml/L EDTA 溶液,再加蒸馏水定容至 500ml,室温保存。

    (2)琼脂糖溶液(1.0%):

    50×TAE 溶液取 10ml,稀释成 500ml,取 50ml 溶解 0.5g 琼脂糖,电炉上煮至沸

    腾,溶化的琼脂物冷却至 60°C左右时加入 10mg/ml EB 5ul,充分混匀,将温热的凝

    胶倒入已置好梳子的电泳板中,在室温下放置 45min 左右后进行电泳。 (3)溴化乙锭(EB)(10mg/ml):

    在 20ml 水中加入 0.2g 溴化乙锭,磁力搅拌数小时。然后用铝箔包裹容器或将溶液 转移至棕色瓶中,室温保存。

    (4)加样缓冲液(Loading Buffer)一般为 6×Loading Buffer

    二,电泳鉴定时注意事项:

    佩戴一次性手套,避免皮肤接触 EB。无路做胶还是电泳缓冲液尽量用新的,不要超过

    两周。

    五,电泳步骤

    1, 50×TAE 取 10ml 稀释成 500ml,取 50ml 溶解 0.5g 琼脂糖。电炉上煮沸后加入 EB

    5ul。另外 450ml TAE 倒入电泳槽中。

    9, 用透明胶封闭电泳板,琼脂糖溶液冷却至温热时,倒入带梳子的电泳板中,冷却后,

    拔出梳子,放入电泳槽中。

    10, 加样:PCR Marker:1ul Marker+1ul Loading Buffer+4ul TAE 混匀于塑料膜上,

    加入孔中。PCR 样品:5ul 样品 DNA+1ul Loading Buffer 混匀后依次加入孔中。 11, 接上电源,电压 120V,电流 50mA 进行电泳。

    12, 电泳约 1 小时后,紫外灯检测。

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