RNA抽提、逆转录(RT)、聚合酶链式反应(PCR)、电泳鉴定

作者：荧光定量PCR仪   发布时间：2020-07-24

    RNA抽提
    一，准备工作

    1， 实验器具与材料:

    RNA 抽提

    (1) 移液枪:1ml、200ul、10ul

    (2) 吸头:1ml、200ul、20ul

    (3) 吸头台:放置1ml吸头的一个，放置200ul和20ul的吸头一个 (4) EP管1.5ml、100ul

    (5) 玻璃研磨器

    (6) 容量瓶:1000ml

    (7) 盐水瓶:100ml

    (8) 15ml塑料管一个(配75%乙醇用)

    2， 实验器具的处理与准备

    (1) 塑料制品:(包括吸头、EP管等)

    将塑料制品逐个浸泡于 1‰DEPC 水中(必要时小枪头需要用吸管打入 DEPC 水)37°C过夜，然后送至高压 3 次，后在 80°C烘烤箱中烘干(或置于 37°C中 8 小时左右烘干)，试验前将枪头放入吸头台。

    (2) 玻璃制品:(主要是玻璃研磨器)

    先泡酸过夜，冲洗干净后，在 1‰DEPC 水中泡 8 小时左右，37°C烘干，用蒙锡 纸包裹送至干烤 3 次。

    (3) 金属制品:(镊子等)

    先洗干净，再送干烤 3 次。(不需要泡 DEPC 水)

    3， 试剂配制和准备:

    (1) DEPC水:泡实验器具的DEPC水的配制:1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在

    1000ml 容量瓶中静置 4 小时后备用。配 75%乙醇的 DEPC 水的配制:100ml

    盐水瓶内装 40ml 双蒸水，加 40ulDEPC，37°C过夜，送至高压。

    (2) 75%乙醇(要在抽提时现配):用无水乙醇和DEPC水配制(DEPC水:无水乙

    醇=1:3)，然后放于-20°C备用。

    (3) 异丙醇:放入棕色瓶

    (4) 氯仿:放入棕色瓶

    (5) Trizol:100ml/瓶 存放于4°C

    二，抽提时注意事项:

    全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤换，避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。

    三，抽提步骤

    1. 匀浆化作用

    取约 100mg 鼠脑组织放于玻璃研磨器内，先加 0.2ml 的 Trizol 溶液，研磨组织后，倒 入 1.5mlEP 管中，再在研磨器内加入 0.8ml 的 Trizol 溶液洗，后全部再倒入 EP 管中。 颠倒混匀 10 下，室温静置 5 分钟。

    2. 分离阶段

    每 1mlTrizol 中加 0.2ml 氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管 15 秒，使其充分混匀， 室温静置 5 分钟。后 12000rmp 离心 15 分钟。

    3. RNA 的沉淀

    将上层水相转入新的 1.5mlEP 管中(约 400-500ul)，加入 0.5ml 异丙醇，混匀后放于-20 °C中 1 小时，后 12000rmp 离心 10 分钟。

    2

    6，RNA 的保存

    提取的 RNA 保存于-70°C超低温冰箱中，或立即用于逆转录。

    组织 100mg

    ↓

    加 1mlTRIzol

    ↓

    匀浆(要彻底，后转至 EP 管) (组织匀浆量>100mg 时分装 1ml/每 EP 管)

    ↓

    颠倒混匀 10 下，室温 5 分钟

    ↓

    加氯仿 1/5 体积(0.2ml)(必须按总体积的 1/5)

    ↓

    颠倒混匀 15S，室温 5 分钟

    ↓

    4°C，离心 12000rmp，15 分钟

    ↓

    转上层水相(约 400-500μl)于另一新 1.5mlEP 管中

    ↓

    加等体积异丙醇(约 400 -500μl)，混匀后-20°C中 1 小时 ↓

    4°C，离心 12000rmp，10 分钟

    ↓

    弃上清

    ↓

    加冰预冷的 75%乙醇(用高压后的 DEPC 水配)1ml

    ↓

    4°C离心 7500rmp，5 分钟

    ↓ 弃上清，超净工作台开风机干燥约 30 分钟(不能完全干燥) ↓

    溶于 DEPC 水中至 20μl(10μl-20μl)

    (可在 55-60°C水中，<10 分钟助溶)

    ↓

    立即保存于-70°C超低温冰箱中，或立即用于逆转录

    细胞 1×107

    3

    4. RNA 的洗脱

    小心倒掉上清，留取沉淀。加 1ml 现配的 75%的乙醇(预冷)振荡洗涤 RNA 沉淀一次， 后 7500rmp 离心 5 分钟。

    5. RNA 的再溶解

    小心倒掉上清，取沉淀置超净工作台开风机吹干(约 30 分钟，此时 RNA 沉淀变透明)。 注意不能让 RNA 沉淀完全干燥(会极大地降低它地可溶性)。再在管中加 20ul 的 DEPC 水溶解，在 55-60°C下孵育 10 分钟助溶。

    TRIzol 法抽提总 RNA

    细胞用 1ml 加样 器吹至液体澄清 且无细胞团块

    逆转录(RT)

    一，准备工作

    1， 实验器具与材料: (1)移液枪:200ul、10ul (2)吸头:200ul、20ul (3)EP 管 1.5ml、100ul (4)水浴箱 2，实验器具的处理与准备

    逆转录(RT)

    塑料制品:(包括吸头、EP 管等)

    将塑料制品逐个浸泡于 1‰DEPC 水中(必要时小枪头需要用吸管打

    入 DEPC 水)37°C过夜，然后送至高压 3 次，后在 80°C烘烤箱中烘干(或置于

    37°C中 8 小时左右烘干)，试验前将枪头放入吸头台。 3，试剂配制和准备:

    (1)DEPC 水:泡实验器具的 DEPC 水的配制:1000ml 双蒸水中加 1mlDEPC，放在 1000ml 容量瓶中静置 4 小时后备用。逆转录中所用的 DEPC 水的配 制:100ml 盐水瓶内装 40ml 双蒸水，加 40ulDEPC，37°C过夜，送至 高压，后分装到几个 1.5mlEP 管中，-20°C中保存备用。

    (2)RT 中所需要的各种试剂 (3)引物浓度计算方法: (新合成的引物的稀释)

    假如终浓度为X uM(pmol/ul)

    加DEPC水体积(ul)=(OD×33×1000000)/(分子量×X) 二，RT 时注意事项:

    为避免 RNA 酶污染，在 RT 中仍要佩戴一次性手套和口罩。 三，RT 步骤

    用 SSIII逆转录酶进行 RT(20ul 体积)

    1， 准备0.65ml的EP管

    2， 冰上操作:在EP管中加入10ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA，1uldNTP，短 暂离心。

    3， 65°C水浴5分钟后，立刻0°C冰水浴至少1分钟。

    4， 短暂离心后，冰上操作:加入4ul5×First-StrandBuffer，1ul0.1MDTT，1ulRNAse Inhibitor，1ul SSIII逆转录酶。

    5， 短暂离心

    6， 50°C水浴60分钟进行逆转录。

    7， 70°C水浴15分钟灭活逆转录酶

    8， -20°C保存，或立即进行PCR。

    用 AMV 逆转录酶进行 RT(10ul 体积)

    1， 准备 0.65mlEP 管

    2， 加入 4.5ul DEPC 水，1ul 引物，1ul 模板 RNA

    3， 稍离心，100°C沸水裕 1min

    4， 加入 0.5uldNTP，2ul 5×Buffer，1ul AMV 逆转录酶 5， 稍离心，封口膜封口，42°C水浴 90°C作 RT

    6， 100°C沸水裕 3min 灭活 AMV

    7， 立即 PCR 或-20°C保存。

    聚合酶链式反应(PCR)

    二，准备工作

    8， 实验器具与材料: (1)移液枪:200ul、10ul (2)吸头:200ul、20ul

    (3)吸头台:放置 200ul 和 20ul 的吸头一个 (4)EP 管 1.5ml、100ul

    2，实验器具的处理与准备

    (1) 塑料制品:(包括吸头、EP 管等)

    送至高压 3 次，试验前将枪头放入吸头台。 3, 试剂配制和准备:

    (1) 双蒸水: 100ml 盐水瓶内装 40ml 蒸馏水，送至高压，后分装到几个 1.5mlEP 管中， -20°C中保存备用。

    (2) PCR 中所需要的各种试剂 三，PCR 时注意事项:

    佩戴一次性手套，同时避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。

    四，PCR 步骤

    1， 准备 100ul EP 管

    2， 依次在管中加入:(50ul 反应体系)

    ddH2O

    10mM dNTP

    10×PCR buffer

    25mM Mgcl2 (加之前要摇匀) 上游引物

    下游引物

    模板cDNA 1ul

    3， 稍离心

    4， 100°C沸水浴 1 分钟

    5， 趁热加入 Tag 酶 0.5ul(冰上操作) 6， 再加入 50ul 液体石蜡封闭

    7， 10000rmp 离心 1 分钟

    8， PCR 条件

    94°C 1min

    58°C 50sec

    72°C 1min30sec

    进行 40 个循环，然后 72°C 10min 完后 4°C保温。

    9，10000rmp 离心 5min

    10，将下层水相转入新的 0.65mlEP 管中，-20°C保存。

    电泳鉴定

    一，准备工作

    1，实验器具与材料:

    (1)移液枪:10ul

    (2)吸头:20ul

    (3)吸头台:放置 200ul 和 20ul 的吸头一个 (4)三角烧瓶:50ml 一个

    (5)琼脂糖 2，实验器具的处理与准备

    (1) 塑料制品:(包括吸头等)

    送至高压 3 次，试验前将枪头放入吸头台。

    (2)电泳板及电泳槽: 用自来水冲洗干净备用

    3, 试剂配制和准备:

    (1) 电泳缓冲液(TAE):

    先配制 0.5mol/L,PH8.0 的 EDTA 溶液:将 37.2g EDTA-Na 加入 160ml 蒸馏水中， 在搅拌器上剧烈搅拌。在用 NaOH 调节溶液 PH 值至 8.0(约需 4gNaOH)。用蒸馏水 定容至 200ml。后送至高压灭菌。室温保存。

    再配制 50×TAE 溶液:在 400ml 蒸馏水中溶解 121g Tris 碱，加入 28.55ml 冰乙 酸和 50ml 0.5ml/L EDTA 溶液，再加蒸馏水定容至 500ml，室温保存。

    (2)琼脂糖溶液(1.0%):

    50×TAE 溶液取 10ml，稀释成 500ml，取 50ml 溶解 0.5g 琼脂糖，电炉上煮至沸

    腾，溶化的琼脂物冷却至 60°C左右时加入 10mg/ml EB 5ul，充分混匀，将温热的凝

    胶倒入已置好梳子的电泳板中，在室温下放置 45min 左右后进行电泳。 (3)溴化乙锭(EB)(10mg/ml):

    在 20ml 水中加入 0.2g 溴化乙锭，磁力搅拌数小时。然后用铝箔包裹容器或将溶液 转移至棕色瓶中，室温保存。

    (4)加样缓冲液(Loading Buffer)一般为 6×Loading Buffer

    二，电泳鉴定时注意事项:

    佩戴一次性手套，避免皮肤接触 EB。无路做胶还是电泳缓冲液尽量用新的，不要超过

    两周。

    五，电泳步骤

    1， 50×TAE 取 10ml 稀释成 500ml，取 50ml 溶解 0.5g 琼脂糖。电炉上煮沸后加入 EB

    5ul。另外 450ml TAE 倒入电泳槽中。

    9， 用透明胶封闭电泳板，琼脂糖溶液冷却至温热时，倒入带梳子的电泳板中，冷却后，

    拔出梳子，放入电泳槽中。

    10， 加样:PCR Marker:1ul Marker+1ul Loading Buffer+4ul TAE 混匀于塑料膜上，

    加入孔中。PCR 样品:5ul 样品 DNA+1ul Loading Buffer 混匀后依次加入孔中。 11， 接上电源，电压 120V，电流 50mA 进行电泳。

    12， 电泳约 1 小时后，紫外灯检测。