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常见问题

荧光定量PCR体系如何加样?

作者:捷瑞   发布时间:2020-07-21

    PCR反应体系中,各试剂加样量是如何确定的,DNA模板怎么提取,PCR体系。这个小小管子里都有什么东西、需要加多少呢?今天一起来看一下关于PCR体系的加样各种问题。

    关于体系

    PCR技术问世于上世纪80年代。问世之初的PCR体系比较大,动辄以毫升计。现在的PCR体系要精巧多了,总体积可大可小。我们常接触到的常规PCR以及荧光定量PCR的体系一般都在几十微升,小到可以10微升左右。下面是一个10微升的荧光定量PCR体系。
    10微升的荧光定量PCR体系

    早期的PCR体系,里面的组分都是各自独立加样的,包括DNA模板、上游引物、下游引物、dNTP、Buffer、MgCl2、聚合酶、水(见下图)。所以早年间做一管PCR需要加样7——8次才能加完一管。现在就简化多了。除了特异的 DNA模板与引物以外,其他几种成分可以做到混在一起,做为PCR Mix统一加样。这样每个管一般只需做4次加样操作即可完成,工作量减少近一半。
    PCR mix

    DNA模板来源

    DNA模板一般来自于从组织中提取的DNA、或者从RNA逆转录得到的cDNA。很多经验表明,逆转录得到的cDNA一般要稀释10倍再做荧光定量PCR,这样得到的CT值会在一个比较理想的范围内。当然这并不是固定的做法,还要根据你的实际情况来做调整。用于PCR的引物浓度,比较常用的是10 p mol/ul、等于10 uM。注意单位哦。

    PCR mix

    PCR Mix由于已经是现成的,所以你不必调节里面的组分。放心,组分肯定是够用的。因为在一个PCR体系内,引物和dNTP、酶等都是足量甚至过量的。当然PCR Mix并不是简单的把那几种成分一古脑混在一起就行的,里面还需要特殊成分以维持其稳定性。对于荧光定量PCR用的Mix,里面还会预混有荧光染料。
    dna

    如果你对DNA聚合酶有特殊要求,不想简单的采用PCR Mix,那么你可以单独选择你要的那种酶,以及相应的其他组分相配合。

    关于体系中的水

    水是用于补齐总体积的。PCR由于成分多、各成分又有不同体积,所以加起来的总体积可能并不刚好是理论上的总体积。计算总体积一般要参考其中的Buffer的体积。如果是10 x Buffer,那么总体积就应该是10 x Buffer体积的10倍。如果达不到这么多,就加水补齐。如果PCR Mix以及模板和引物的总体积是刚好的,就可不必加水了。

    早年的PCR体系往往还要加另一种成分:液体石蜡油。在PCR总体系配制完成后,最后再在上面加一层液体石蜡油。液体石蜡油比较轻,会漂浮在上面,可防止体系中的水分挥发。这是一种简单但很实用的做法。现在的PCR管密封很好,又有完善的热盖系统,所以这种做法现在已经不太常见了。

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