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常见问题

新型冠状病毒核酸检测与PCR技术普及

作者:陆广琴   发布时间:2020-07-17

    2020年伊始,一种由新型冠状病毒(2019-nCoV)感染引起的肺炎在我国爆发并迅速蔓延,每一天都牵动着亿万人民的心。随着抗击疫情一线的科研人员、医务人员和国家强有力的防控措施,我们已经取得了很好的控制。新冠状病毒检测除了通过临床表现,技术上有CT检测肺部影像学特征、病毒核酸检测和抗原抗体检测等方法,其中作为早期诊断最主要的分子诊断方法——核酸检测所涉及到的PCR技术也逐渐被大众所熟知。
    在介绍使用PCR技术进行病毒核酸检测之前,我们先来了解一下新型冠状病毒(2019-nCoV)的结构和特征吧。
    冠状病毒是一个大型病毒家族,2019-nCoV是一种新型冠状病毒,形态呈圆形或椭圆形,常为多形性,直径60——140 nm,有包膜,包膜上有蘑菇状棘突蛋白使病毒颗粒外形如日冕或冠状。下面两张图片分别是中国疾病预防控制中心和香港大学公布的2019-nCoV病毒电子显微镜照片,箭头所指为病毒颗粒(左图),右图显示了在细胞中生长的新型冠状病毒。
    病毒颗粒新型冠状病毒
    冠状病毒结构示意图
    冠状病毒结构示意图(图片来源:网络)
    上图显示的是2019新型冠状病毒所属的家族——冠状病毒的结构示意图,其内部遗传物质为单股正链RNA,基因组全序列有近三万个碱基,编码的主要结构蛋白有:棘突蛋白(S,Spikeprotein)(是侵染宿主细胞关键)、包膜蛋白(E,Envelopeprotein)、膜糖蛋白(M,MembraneglycoProtein)和核蛋白(N,Nucleocapsidprotein)。我国科学家通过基因测序已获得完整的2019-nCoV的基因组序列数据(RefSeq数据库编号为:NC_045512.2),如下图所示。这些基因组数据,为进行核酸检测和研究分析其进化来源、致病机制提供了第一手资料。
    知道了病毒全部基因组序列,怎么样检测一份未知的样品呢?
    首先需要采集患者的病毒样本,而由于采集的临床标本中病毒含量往往是非常少的,提取分离出的遗传物质更加少,需要扩增到可检测数量,才能做出诊断,即需要做PCR反应,它叫作聚合酶链式反应(PolymeraseChain Reaction),实际上就是一个基因的扩增反应。由于2019新型冠状病毒为RNA病毒,可以通过逆转录与荧光定量PCR(RT-PCR)技术相结合的方法,即将待测RNA样本进行逆转录得到cDNA,再根据病毒基因组序列中保守性且特异性靶核酸如编码N蛋白基因序列设计引物和探针,再以其为模板进行PCR扩增,同时通过荧光探针实时检测扩增产物,可以做到病毒的快速定量检测,来起到诊断和监测病原体的作用,基本步骤如下面框图所示。
    基本步骤
    【知识链接】聚合酶链式反应(PCR):
    聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。因此,无论是化石中的古生物、历史人物的残骸,还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液,只要能分离出一丁点的DNA,就能用PCR加以放大,进行比对,这也是“微量证据”的威力之所在。由1983年美国Mullis首先提出设想,1985年由其发明了聚合酶链式反应,即简易DNA扩增法,意味着PCR技术的真正诞生,到如今,PCR已发展到第三代技术——数字PCR技术。1976年,中国科学家钱嘉韵,发现了稳定的Taq DNA聚合酶,为PCR技术发展也做出了基础性贡献。
    具体过程是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链,低温(一般是60°C左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合,再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72°C左右),DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备,能在变性温度,复性温度,延伸温度之间很好地进行控制。经30个左右的温度循环,可使目的片段得到指数级的扩增。那么,反推可知,能检测到大量DNA目的片段的即是阳性样品。
    PCR的基本原理可以用下面的示意图进行表示,左边部分是反应体系的成分组成,右边是一个循环的反应过程。
    PCR的基本原理
    面对这次疫情,科学家和医生也需要时间,对该病毒的认识和防控是一个相当长期艰巨的任务。随着研究的不断深入,相信人类在与病毒的这场斗争中会最终取得成功!

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