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常见问题

RNA模板、引物类型、反转录酶详解

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2020-07-16

    逆转录 PCR(Reverse TranscriptionPCR, RT-PCR)是一种以 RNA 为样本,RNA链被逆转录成为互补 DNA(cDNA),再以此为模板通过 PCR 进行 DNA 扩增。在实际应用中,RT-PCR 分为一步法 RT-PCR 和两步法 RT-PCR。整个反转录实验过程有三个重要的因素,分别是RNA模板、反转录时所使用的引物类型、反转录酶 。

    RNA模板

    RNA模板

    高质量的 RNA 基本有几个参数可供参考,首先是 OD260/280 以及 OD260/230的值应该都是 2.0 左右,如果 OD260/280 小于 1.9,说明 RNA 中有一些蛋白质的残留,如果这个值大于 2.1,则很可能样本中 RNA 有一定的降解。OD260/230如果小于 2.0,说明 RNA 中含有异硫氰酸胍,酚残留,而这些物质对逆转录反应影响是非常大的。另外就是琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的完整性,正常的 RNA一般呈现三条带,即 5s、18s、28s,其各自的亮度呈现递增状态,依据物种不同可逆转录 PCR能存在些许差异。当 RNA 出现降解时,反馈最明显的是 5s rRNA 的亮度显著提高。下图展示的分别是高质量 RNA、稍有降解以及完全降解的实例:

    5s rRNA 的亮度

    提取到了高质量的 RNA模板后,下一个需要考虑的问题便是引物的选择了。通常,反转录引物有三类,分别是 oligodT、随机引物和序列特异性引物:oligodT引物能特异性结合在含有 polyA 尾的 mRNA 末端起始反转录反应,但这一特性决定了它只能扩增含有 polyA 尾的 mRNA,而且对 RNA 模板的质量要求较高,一旦 polyA 尾发生降解,就不能被引物所识别,从而导致产物中没有相应基因的cDNA;随机引物一般含有 6-9 个随机序列的碱基,能够随机识别结合在 RNA 模板上,因此这类引物的优点在于能同所有类型的 RNA 结合,而且比较适合于含有二级结构的 RNA 及微量样本,具有较高的反转录灵敏度。
    反转录引物

    但缺点在于,结合的随机性会造成 cDNA小片段较多,有时候还会对微量目的片段造成稀释;序列特异性引物,顾名思义,针对于特定的序列设计的反转录引物,用于特异性的反转录某一段序列。在实际的应用中,我们通常会研究同一个个体或细胞中不同基因表达水平的变化,因此序列特异性基因相对用的少一些。Solis BioDyn 可供的反转录预混液中可提供多种不同的引物(oligodT、随机引物、以及 oligodT 与随机引物的结合)供您选择,满足您的一切实验需求!

    逆转录酶

    Solis BioDyn 可提供两种逆转录酶:分别是 MMLV(RNase H+)和 SOLIScript(RNase H-)逆转录酶。RNase H,是一种核糖核酸内切酶,可以特异性地水解DNA-RNA 杂合链中的 RNA,不能水解单链或双链 DNA 或 RNA。

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