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常见问题

PCR引物设计流程,每一个步骤都很详细

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2020-07-14

    你的PCR设计引物究竟从何而来?这个问题似乎很多实验新手小白在刚刚接触PCR实验的时候还来不及思考。今天给大家总结的PCR引物设计流程如下:

    先几个比较好用的PCR引物数据库

    Primerbank(HS and MM)

    http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/

    OriGene

    https://www.origene.com/category/gene-expression/qpcr-primer-pairs

    qPrimerDB

    https://biodb.swu.edu.cn/qprimerdb/

    RTPrimerDB

    http://www.rtprimerdb.org

    NCBI Probe

    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe
    PCR引物数据库

    引物设计流程

    1. 获取序列

    登陆NCBI, Gramene, EBI等核酸数据库,收索相关序列并根据需求下载目标格式文件。
    获取序列

    2. 序列编辑与整理

    可以通过DNAman, DNA star ,Geneious等软件将下载好的序列进行编辑整理。
    序列编辑与整理

    3. 引物定位

    推荐软件:Blastn/p,ClustalW。
    引物定位

    4.引物设计

    推荐软件:Primer Premier,还可以利用高级引物功能,进行引物数据库收索,巢式引物设计,引物编辑分析等其他功能。
    引物设计

    5.获取序列

    结合设计出的引物和序列编辑整理软件获取扩增后目标序列,并进行比对分析;并指导引物定位和序列编辑整理。
    获取序列

    6.引物综合评价

    推荐软件Primer Blast,Oligo等。

    评价指标:Tm值,GC含量,长度,二级结构,结合位点特异性,可以通过软件对这些指标进行评定,特别是实时定量PCR原理实验,引物的扩增效率对检测准确性的影响非常大。
    引物综合评价

    定量PCR引物的验证和具体评价方法

    设计原则

    产物长度在80-300bp之间

    产物GC含量在50-60%之间

    引物的GC含量在50-60%之间,熔解温度在55-65℃之间

    应避免引物中有连续的G或C,但推荐在引物的末端含有G或C

    应避免出现二级结构

    验证方案

    标准曲线法。

    制作标准曲线,选择合适的标准品作为扩增模板,梯度稀释,扩增结束后以模板系列稀释倍数log值为X轴,以对应的Ct值为Y轴(反之亦可),制作标准曲线。

    扩增效率(E)计算公式:E=10-1/斜率-1

    即一般认为扩增效率应介于90——110%之间,与之相对应的斜率介于-3.58——-3.1之间。

    在其它参数正常的前提下,即可判定定量PCR引物扩增效率良好。

    通过数据库或者软件获得的引物序列,对引物的各种指标进行评定,可以对引物的扩增效率有一个前瞻性的认识,特别是定量PCR实验,引物的扩增效率对检测准确性的影响非常之大。

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