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常见问题

荧光定量PCR仪性能怎么看,要注意哪些?

作者:赛默飞   发布时间:2020-07-13

    作为分子生物学划时代的产品,荧光定量PCR在各个领域,包括人类身份鉴定,都有广泛应用。那么,怎么衡量荧光定量PCR仪的性能,怎样选择一款既适合实验要求、“性价比”又高的仪器呢?我们一起拆机看看吧。

    荧光定量PCR仪性能

    作为一款检测设备,对qPCR仪最重要也是最基本的要求是检测的准确性,因此,在选择时,最关键的一点就是衡量仪器的检测灵敏度、准确性和稳定性。

    检测灵敏度:也就是能检测到的最低量,一款好的荧光定量PCR仪是可以达到单拷贝检测灵敏度的。

    仪器准确性和稳定性:就是指结果能够准确反应目标基因的量,并且重复多次实验能够达到一致结果;对于多重反应来说,能够区分不同浓度差异的目标片段,同时具有很好的重复性。性能好的荧光定量PCR仪可以检测1.5拷贝浓度差异的目标片段,10个数量级线性检测范围。

    你知道吗?实验具体数据同样很重要!

    除了从仪器性能描述中判断性能以外,还需要一些实验数据直接判读,来更明确和直观了解仪器性能。
    实验数据
    实验数据

    仪器的性能是仪器构造和仪器所使用的技术的直接反应,要达到高灵敏度、检测准确度和良好重复性的仪器,一定是仪器技术、设计、制造、各部件综合协作的成果。下面就让我们来拆机看看,仪器用了哪些技术,对仪器性能又有怎样的影响?

    荧光定量PCR仪构造

    qPCR仪包括光路系统、检测器、热循环模块和分析软件。让我们一起拆机看看,里面应用了哪些技术?

    常用的荧光激发方式有三种:

    激光

    激光是纯粹的单色光,用来做荧光染料的激发光强度超级高而且基本上没有背景干扰,但激光光源的价格也和性能一样高高在上,市场上只有最高端的定量PCR设备才会使用激光光源,价格和性能都令我们绝大多数的普通用户高山仰止。

    卤钨灯

    相对于中低端设备使用的单色LED而言,卤钨灯或者氙灯的价格比较贵,需要定期维护和更换,但激发光的光谱范围比较宽,相对光强也较强。过去卤钨灯一般都会在中高端定量设备中配合冷CCD检测器使用,近年来随着白光LED技术的发展,因寿命长和良好的性能表现,逐步登上并占据了定量PCR的硬件舞台。

    LED

    单色LED光源成本低、寿命长,使用期间基本无需维护,目前在中低端定量PCR市场中几乎占据了统治地位;近几年发展起来的白光LED兼具卤钨灯光谱范围宽和LED性能稳定寿命上的优点,在中高端定量PCR仪中使用较多,但需要注意的是各个厂商所使用的白光LED性能各异,有些劣质LED的光谱范围不够平均,就会导致某些特定激发通道的光强明显低于其他通道。

    在定量PCR设备中主要使用滤光片进行单色滤光,光栅型单色系统在定量PCR设备中比较少见。

    定量PCR设备使用的荧光检测元件常见的也有两种,光电倍增管(PMT)和CCD/CMOS芯片,PMT多用于中低端设备,使用扫描检测模式,在灵敏度上PMT几乎可以达到CCD/CMOS检测的同等水平,但由于光电倍增的工作原理,使用PMT检测一般背景噪音会相对较高,信号基线不够稳定,尤其在孔间和板间重复性上表现明显弱于CCD类型的检测设备。CCD/CMOS价格比较高,一般用于中高端定量PCR设备,使用CCD/CMOS检测的设备一般在孔间重复性上明显好于扫描设备,复孔之间的实验结果相对偏离会较小。

    目前市场上还有一些使用光电二极管(PDT)进行检测的定量设备,这种检测元件在成本上与PMT相当,检测结果的背景噪音低于PMT设备,但由于信号放大过程后置,所以检测灵敏度要低于使用PMT和冷CCD的设备,直接的表现就是相同样本检测的时候Ct值出得会比较大。

    关于光路系统另一个重要考虑因素就是检测通道数。定量PCR设备通过不同的激发和发射滤光片组合,可以同时检测多种不同的荧光染料,也就是我们所说的检测通道数。

    市场上常见的定中低端荧光定量PCR仪一般会提供2-3个检测通道,高端设备一般都具有5-6个检测通道,我们在选择通道数量时应该根据自己的实际使用需要来进行选择。对于实验条件和对象经常变化的研究型实验室来说,多通道不但意味着可以同时进行多重实验,也同时提供了极高的染料和方法适应能力。

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